第二节　真菌检查

一、直接镜检

（一）适应证

适用于各种浅部、深部真菌病的诊断与鉴别诊断。

（二）禁忌证

无特殊禁忌。

（三）步骤

1.直接涂片

（1）标本准备：

浅部真菌病（头癣、体股癣、手足癣、甲真菌病、花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎、皮肤及黏膜念珠菌病等），用钝刀刮取皮损边缘部的皮屑，也可用透明胶带粘贴鳞屑，或用小刀刮取变色松脆的甲屑，用拔毛镊拔取病发，用镊子夹挤毛囊角栓。

深部真菌病（孢子丝菌病、着色芽生菌病、暗色丝孢霉病、毛霉病等）：根据病变可取脓液、痂等。

（2）镜检操作：

标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶。然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭子或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。

（3）典型真菌镜检所见

1）花斑糠疹：

短粗、两头钝圆、稍弯曲的菌丝，成堆球形或卵圆形厚壁出芽孢子。

2）马拉色菌毛囊炎：

球形厚壁出芽孢子。

3）头癣：

黄癣，顺头发长轴排列的发内菌丝，关节孢子及气沟、气泡，黄癣痂内鹿角状菌丝、大小不等的孢子；白癣，发外镶嵌性小孢子；黑点癣，发内链状大孢子。

4）体股癣、手足癣：

分枝分隔的长菌丝。

5）甲癣：

分枝分隔的菌丝或呈关节样菌丝。

6）念珠菌病：

假菌丝、圆形或椭圆形孢子，有出芽。

7）着色芽生菌病：

棕色圆形厚壁分隔孢子（硬壳细胞）。

8）暗色丝孢霉病：

棕色分枝分隔菌丝或酵母样细胞。

9）曲霉病：

45°分隔分枝菌丝。

10）毛霉病：

宽大菌丝，90°分枝，不分隔。

2.墨汁涂片

用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。

（1）在载玻片上滴一小滴墨汁（最好是印度墨汁）。

（2）取皮肤感染脓性分泌物或脑脊液一滴，经接种环与墨汁充分混合，盖上盖玻片。

（3）直接在显微镜下观察，隐球菌为圆形或椭圆形双壁孢子，外围有一层透光荚膜，在黑色背景下极为明亮。

（四）注意事项

1.拔毛镊或钝刀在使用前后，均应用火焰消毒并冷却后使用。

2.拔发时可用放大镜、皮肤镜或在滤过紫外线灯下选择病发。

3.镜检时所见菌丝或孢子应注意与纤维、表皮细胞间隙、气泡、油珠等相鉴别。

4.标本与墨汁混合后不必加热直接镜检。

二、真菌培养

（一）适应证

适用于各种浅部、深部真菌病诊断和鉴别诊断，以及致病真菌的分离、鉴定或药敏试验。

（二）禁忌证

无特殊禁忌。

（三）步骤

1.标本准备

浅部真菌病同直接镜检。深部真菌病（孢子丝菌病、着色芽生菌病、暗色丝孢霉病、毛霉病等）的组织或脓液标本需无菌采集；活检组织标本应置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1mm×1mm×（1～2）mm的小块。

2.培养操作

分为试管培养、大培养和小培养三种方法。

（1）试管培养：

将培养物接种在试管斜面培养基，主要用于临床标本分离的初代培养和菌种保存。

（2）大培养：

将培养物接种在培养皿或特殊培养瓶内，主要用于纯菌种培养和研究。

（3）小培养：

主要用于菌种鉴定，分为玻片法、方块法和钢圈法三种方式。

1）玻片法：

在消毒的载玻片上，均匀地浇上熔化的培养基，不宜太厚。凝固后接种待鉴定菌株，置于平皿中，保湿。待生长后，盖上消毒的盖玻片，显微镜下直接观察，常用米粉吐温琼脂培养基观察白念珠菌的顶端厚壁孢子和假菌丝。

2）方块法：

适用于真菌菌落的培养。取无菌平皿倒入约15ml熔化的培养基，待凝固后用无菌小铲或接种刀划成1cm×1cm大小的小块。取一小块移在无菌载玻片上，然后在小块上方四边的中点接种待鉴定菌株，盖上消毒的盖玻片，放入无菌平皿中的“V”形玻棒上，底部铺上无菌滤纸，并加入少量无菌蒸馏水孵育，待菌落生长后直接将载玻片置显微镜下观察。

3）钢圈法：

先将固体石蜡加热熔化，取直径约2cm，厚度约0.5cm有孔口的不锈钢小钢圈，火焰消毒后趁热浸入液态石蜡中，立即取出冷却，液态石蜡即附着于小钢圈中。再取一无菌载玻片，火焰上稍加热，将小钢圈平置其上，孔口向上。小钢圈上液态石蜡遇载玻片的热即熔化后凝固，钢圈就会固定在载玻片上。用无菌注射器经孔口注入熔化的培养基，培养基量约占小钢圈容量的1/2，注意避免产生气泡。待培养基凝固后取一消毒盖玻片，火焰上加热后，趁热盖在小钢圈表面，即固定其上，最后用接种针伸入孔口进行接种。

3.培养检查

标本接种后，每周至少观察2次。

（1）菌落外观

1）生长速度：

缓慢生长菌7～14日，快速生长菌2～7日。一般浅部真菌超过2周或深部真菌超过4周仍无菌落生长，可报告阴性。

2）外观：

①扁平；②疣状；③折叠规则或不规则；④缠结或垫状；⑤其他。

3）大小：

菌落大小测量以cm为单位，菌落大小与生长速度和培养时间有关。

4）质地：

①平滑状；②粉状；③粒状；④棉花状；⑤粗毛状；⑥皮革状；⑦黏液状；⑧膜状。

5）颜色：

不同菌种表现出不同颜色，呈鲜艳或暗淡。致病性真菌的颜色多较淡，呈白色或淡黄色，而且其培养基也可变色，如马尔尼菲青霉菌可产生葡萄酒样红色色素扩散于培养基中。菌落的颜色与培养基的种类、培养温度、培养时间、移种代数等因素有关。菌落颜色虽在菌种鉴定上有重要参考价值，但除少数菌种外，一般不作为鉴定的重要依据。

6）菌落边缘：

可整齐或不整齐。

7）菌落高度和下沉现象：

有些菌落下沉现象明显（如黄癣菌、絮状表皮癣菌等），有时还可裂开。

8）渗出物：

一些真菌菌落表面可出现液滴（如青霉菌、曲霉菌）。

9）变异：

有些真菌菌落日久或多次传代培养而发生变异，菌落颜色减退或消失，表面气生菌丝增多，如絮状表皮癣菌在2～3周后便发生变异。

（2）显微镜检查：

小培养可置普通显微镜下直接观察，而试管和平皿培养的菌落则需挑起后做涂片检查。

常见真菌培养所见：①念珠菌病，奶油色酵母样菌落；②隐球菌病，乳白色酵母样菌落，而后为浅橘黄色，质地呈黏液状；③孢子丝菌病，棕色至棕黑色菌落；④曲霉病，黄绿色毛状菌落；⑤芽生菌病，真菌相为白色棉花样菌落，酵母相为奶油色或棕色菌落；⑥暗色丝孢霉病，棕黑色菌落。

（四）注意事项

1.应结合直接镜检结果综合进行判断。

2.严格无菌操作，避免污染。

3.提倡多管（点）、多次培养，确保结果可信性。

4.由于部分真菌没有特殊结构，或为未知真菌，应保留菌种进一步做DNA测序等分子生物学鉴定。

5.特殊病例取材时应留备份冷冻保存，必要时重复培养或做分子生物学鉴定。