第二节 宿主泛素化系统与结核病

宿主介导的分枝杆菌蛋白泛素化抑制免疫力

2020年1月同济大学附属上海肺科医院戈宝学团队和上海科技大学饶子和院士团队合作在Nature杂志发表了一项最新的研究。为了鉴定Mtb抑制宿主炎症反应的蛋白，他们检测了208个Mtb分泌蛋白和脂蛋白对转录因子NF-κB激活的影响，结果发现Rv0222可抑制NF-κB的激活。在HEK293T细胞中瞬时表达Rv0222也显著抑制NF-κB和另一个转录因子AP-1的激活。Rv0222转染还可以降低感染Mtb的永生化骨髓巨噬细胞（iBMDM）中NF-κB的激活。

（1）目的：

鉴定Mtb抑制宿主炎症反应的蛋白。

（2）方法

1）菌株和细胞：

分枝杆菌基于H37Rv，细胞采用HEK293T、iBMDM、腹腔巨噬细胞、THP1细胞。

2）质粒和抗体：

质粒详见文章附表1。蛋白印迹或免疫沉淀实验使用针对血凝素、GAPDH、Flag、Myc、K11、APC2、磷酸化p65、磷酸化p38、磷酸化Jnk、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）、K11/K48泛素链、Rv0222等的抗体。

3）菌株构建：

用pYUB854构建Rv0222缺失株（H37RvΔRv0222）。用pMV261回补得到H37RvΔRv0222+Rv0222或H37RvΔRv0222+Rv0222（K76A）。通过免疫印迹分析Rv0222或其突变体在分枝杆菌中的表达。

4）小鼠与感染：

从6~8周龄雌性C57BL/6小鼠获取巨噬细胞。Mtb气溶胶感染雌性C57BL/6和SCID小鼠，于1天、7天、14天或30天处死，进行肺组织CFU计数及病理学观察。体外Mtb感染巨噬细胞MOI=5。

5）短发夹RNA（shRNA）介导的基因干扰：

用含不同shRNA的载体转染细胞，48小时后收集慢病毒，并感染iBMDM、HEK293T或THP1细胞，用嘌呤霉素筛选。

6）泛素化测定：

细胞瞬时转染HA-标签泛素质粒。通过免疫印迹检测泛素化Rv0222或TRAF6。体内实验需免疫沉淀洗涤后进行免疫印迹检测。

7）其他实验：

使用脂质体2000瞬时转染HEK293T细胞，共聚焦显微镜观察；pNF-κB-luc、p-AP-1-luc、pRL-TK瞬时转染细胞，采用双荧光素酶报告系统测定荧光；用逆转录定量PCR分析mRNA水平。

8）统计分析：

采用Student’s t检验、方差分析和Bonferroni两两比较、或Mann-Whitney U检验分析组间差异，双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。实验未进行随机化，实验和结果分析未采用盲法。

（3）结果：

感染Rv0222缺失株的巨噬细胞和小鼠肺组织中促炎细胞因子（IL-1b，IL-6，IL-12/IL-12p40）mRNA水平比感染野生株的高得多，但细胞死亡和细菌侵入无明显差异，同时回补实验可以恢复对这些细胞因子的抑制，表明Rv0222可抑制Mtb触发的炎症反应。感染Rv0222缺失株的小鼠肺组织具有更少免疫细胞浸润、更少炎症损伤和更低菌负荷，提示Rv0222是Mtb必需毒力因子。

缺乏Rv0222时，感染H37Rv的巨噬细胞表现出更强的MAP激酶和NF-κB活性，提示Rv0222在Mtb感染时可能抑制p38 MAP激酶、c-Jun氨基末端激酶（JNK）或NF-κB通路的激活。抑制p38、JNK或NF-κB减弱了感染缺失株巨噬细胞IL-1b和IL-6表达水平的增强，提示Rv0222可能通过下调p38、JNK和NF-κB通路的激活来抑制Mtb诱导的促炎细胞因子表达。

研究发现Rv0222与Toll样受体信号通路中的TRAF6相互作用，感染Mtb巨噬细胞的免疫共沉淀和共聚焦显微镜分析也证实了两者的内源性相互作用。shRNA敲低TRAF6可显著减弱Rv0222对Il1b、Il6和Il12 p40表达的抑制作用。以上结果表明Rv0222可能通过靶向TRAF6通路抑制宿主MAP激酶和NF-κB信号的激活。

Rv0222过表达显著抑制HEK293T细胞中TRAF6的总泛素化和K63泛素化，Rv0222缺失则效果相反。Rv0222能促进HEK293T细胞中蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2（SHP1/2）与TRAF6结合，shRNA沉默SHP1/2可消除Rv0222对细胞因子表达的抑制作用，已报道SHP1/2与TRAF6相互作用并抑制其泛素化。这些表明Rv0222促进了SHP1/2与TRAF6的相互作用，从而抑制了TRAF6的激活。

HEK293T细胞中可检测到Rv0222多聚泛素化，共转染Rv0222和野生型泛素（包含所有7个赖氨酸残基）或突变体泛素（只保留1个赖氨酸残基，其余6个用精氨酸替代）至HEK293T细胞，显示K11泛素突变体显著增加了Rv0222的多聚泛素化作用。在感染Mtb的巨噬细胞中也检测到Rv0222上存在内源性K11多聚泛素物。以上实验结果提示Rv0222在宿主细胞中经历K11多聚泛素化。

此外，实验证明泛素连接酶ANAPC2与Rv0222存在相互作用，并显著增加Rv0222K11多聚泛素化，Rv0222的K11多聚泛素物仅存在于ANAPC2，提示此酶在介导Rv0222K11多聚泛素化中直接发挥重要作用。

实验证明宿主ANAPC2可增强Rv0222在K76赖氨酸残基上K11多聚泛素化。后续发现，TRAF6诱导的NF-κB和AP-1报告基因的激活受Rv0222显著抑制，但不受Rv0222（K76A）突变体抑制；与感染H37RvΔRv0222+Rv0222相比，感染H37RvΔRv0222+Rv0222（K76A）的细胞和小鼠肺中的促炎细胞因子mRNA水平均显著升高，表明K76对于Rv0222抑制宿主促炎细胞因子产生至关重要。进一步敲低ANAPC2以及下游通路分子等实验表明，宿主ANAPC2通过促进Rv0222K11多聚泛素化调控该蛋白对细胞因子表达的抑制。

H37Rv、H37RvΔRv0222+GFP、H37RvΔRv0222+Rv0222、H37RvΔRv0222+Rv0222（K76A）四种菌株小鼠感染实验结果显示，C57BL/6小鼠中，H37RvΔRv0222+Rv0222导致更严重的组织学损伤和更多免疫细胞肺部浸润；SCID小鼠中，感染8周时几乎所有感染H37Rv或H37RvΔRv0222+Rv0222的小鼠都死亡，但感染H37RvΔRv0222+GFP或H37Rv∆Rv0222+Rv0222（K76A）的小鼠存活时间较长；野生型Rv0222而非K76A突变体Rv0222的回补，可挽回H37RvΔRv0222+GFP感染小鼠肺组织中的CFU减少。

该研究发现Rv0222是以往未被认识的Mtb免疫信号元件。以往曾报道，含Mtb的宿主细胞膜结构上存在泛素积聚；细菌的一个泛素结合蛋白与宿主的一个信号分子相互作用；分枝杆菌仅具有蛋白质翻译后修饰的类泛素化（pupylation）系统，不具有内源性泛素化系统。该研究揭示了一种利用宿主E3连接酶（ANAPC2）进行Mtb Rv0222泛素化而破坏宿主免疫的机制，突显了宿主与Mtb相互作用的多样性。未来研究将扩展至其他宿主E3连接酶介导泛素化的功能。值得注意的是，ANAPC2介导的Rv0222K11泛素化引发的细胞效应似乎与APC/C触发的降解许多细胞周期调节子不同，其泛素化促进磷酸酶与免疫信号分子结合，而非蛋白酶体的底物识别。该发现可为开发针对Rv0222-ANAPC2的有效抗结核治疗方法奠定基础。

（4）结论：

Rv0222是以往未被认识的Mtb免疫信号元件。利用宿主E3连接酶（ANAPC2）进行Mtb Rv0222泛素化而破坏宿主免疫的机制，突显了宿主与Mtb相互作用的多样性。

［专家点评］

机体中的蛋白质主要通过溶酶体途径和泛素-蛋白酶体途径降解，后者是维持体内蛋白动态平衡的主要途径。泛素是真核生物中广泛存在的一类高度保守的由76个氨基酸组成的小蛋白。泛素蛋白在一系列特殊酶的作用下，可对翻译后的靶蛋白进行特异性的修饰，这个过程被称为泛素化。泛素化是重要的蛋白质翻译后修饰方式。泛素化过程是一个由下列三类酶催化完成的级联反应：首先，泛素激活酶（E1）的半胱氨酸残基与位于泛素C末端的甘氨酸残基在ATP供能下形成硫酯键；而后，E1激活的泛素转移到泛素结合酶（E2）；最后，泛素连接酶（E3）催化泛素从E2转移到靶蛋白上进行修饰。人体中有1 000多个泛素连接酶，它能够将泛素共价结合到靶蛋白的特定赖氨酸残基上。泛素含有7种赖氨酸（即K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63），如果多个泛素形成多泛素链后再连接在靶蛋白的赖氨酸上，被称为多聚泛素化（polyubiquitination），将被26S蛋白酶体降解；如果一个泛素连接在靶蛋白的赖氨酸上，被称为单泛素化（monoubiquitination），单泛素化的靶蛋白一般不会被导入蛋白酶体降解，可能会发生功能或细胞定位的改变。

目前研究发现泛素化修饰有多种形式，参与免疫功能、细胞周期、DNA修复、细胞生长等的调控，与许多疾病的发生密切相关，尤其是一些病原菌能利用宿主的泛素化系统致病。该论文作者Wang L等首次发现宿主E3泛素连接酶ANAPC2可将K11连接的泛素链附着在Mtb Rv0222的第76位赖氨酸上，导致Rv0222多聚泛素化，揭示Mtb通过其效应蛋白Rv0222调节宿主泛素化途径、干扰宿主细胞信号通路，从而有效地抑制宿主的免疫防御，诱导免疫逃逸，促进Mtb的感染、生存和致病。该研究发现的Mtb免疫逃逸机制为结核发病机制提供了新的见解，也将为研发抗结核新药的设计提供新思路和新策略，Rv0222第76位赖氨酸也可能成为抗结核治疗的新靶点。未来尚需更深入地研究ANAPC2-Rv0222及其他泛素化修饰的调控网络和调控效应，为结核病致病机制的阐明和靶向药物的研制提供更有力的科学依据。

点评专家：吴雪琼。