第四节　结核分枝杆菌复合群与自噬相关的免疫逃逸机制的研究

一、牛分枝杆菌通过诱导线粒体自噬抑制宿主异原体自噬促进其胞内存活

线粒体自噬是一种选择性的自噬机制，用来清除损伤的线粒体并且在一些病毒和细菌的免疫逃逸中发挥重要作用。然而，牛分枝杆菌是否能诱导线粒体自噬，这种自噬在牛分枝杆菌的存活中起什么作用，它又是通过何种机制影响牛分枝杆菌存活，当前仍不清楚。

（1）目的：

解析线粒体自噬在牛分枝杆菌存活中的作用并揭示线粒体自噬调控存活的具体分子信号机制。

（2）方法：

首先以牛分枝杆菌感染巨噬细胞（J774A.1）和间充质干细胞为模型，利用免疫印迹、免疫荧光染色、透射电镜等技术研究感染过程中线粒体自噬相关蛋白（LC3B，LAMP1）、线粒体蛋白（TIMM23，HSPD1）的表达水平变化及线粒体共定位情况，随后分析自噬相关信号通路PINK1-PRKN在感染过程中的表达水平，使用小干扰RNA（siRNA）和小分子抑制剂等在体内外两个层面进行此信号通路的功能抑制和激活来验证其对于自噬的影响，牛分枝杆菌的胞内存活和体内感染后诱发损伤的调控效应。

（3）结果：

牛分枝杆菌感染巨噬细胞后，线粒体自噬相关蛋白在线粒体中明显累积而且和线粒体蛋白的共定位比例显著增加，超微结构分析显示线粒体自噬小体形成，表明牛分枝杆菌感染巨噬细胞可诱导线粒体自噬。PINK1-PRKN信号通路的激活是牛分枝杆菌感染诱导线粒体自噬的重要机制，其竞争性利用磷酸化TBK1（p-TBK1）来抑制宿主异源性自噬，从而逃避巨噬细胞杀伤，促进胞内存活，而抑制自噬则可减轻牛分枝杆菌感染诱发的体内组织损伤。

（4）结论：

牛分枝杆菌感染可诱发线粒体自噬并且通过竞争性地利用p-TBK1来抑制宿主异源性自噬从而促进其在胞内的存活和生长，而抑制自噬可减少牛分枝杆菌在体内的存活。

二、结核分枝杆菌真核蛋白激酶G（PknG）通过操纵宿主自噬流来促进病原体在细胞内存活

M. tb是一种胞内病原体，分泌各种效应蛋白逃避宿主免疫清除以在巨噬细胞中生存。然而，M. tb-宿主相互作用的详细分子机制仍不清楚，有待进一步探索，为开发新的结核治疗策略提供思路。

（1）目的：

了解PknG在M. tb感染过程中对宿主自噬的调控作用及其潜在机制，识别与PknG相互作用的宿主因子。

（2）方法：

通过共聚焦显微镜实验在U937细胞中过表达PknG，证实PknG介导的M. tb感染过程中自噬流的调节；通过免疫印迹、共聚焦显微镜实验在U937细胞中证明分枝杆菌感染时巨噬细胞自噬流的阻断；通过小鼠cDNA文库、共聚焦显微镜、免疫沉淀、亲和分离和定量分析等表明M. tb感染期间，PknG可以分泌到宿主细胞中，并与AKT在巨噬细胞中相互作用，PknG促进自噬诱导依赖于AKT结合的PknG C末端区域。

（3）结果：

M. tb PknG以C端区域依赖的方式促进自噬诱导，同时在自噬体/吞噬体成熟阶段以TPR结构域和激酶活性依赖的方式阻断自噬流，增强病原体在巨噬细胞内的存活。

（4）结论：

M. tb PknG是一种双重功能的细菌效应因子，严格调控宿主的自噬流，有利于病原体在细胞内的生存。

三、敲除卡介苗中的BCG_2432c基因可增强自噬介导的抗结核免疫

卡介苗（BCG）是一种减毒活疫苗，但它对结核病的保护不足，其潜在机制尚不清楚。我们假设BCG继承了牛分枝杆菌强毒株的免疫逃逸策略，鉴别相关基因并评估其对疫苗效力的影响。

（1）目的：

探索BCG_3174、BCG_1782和BCG_2432c3个基因敲除突变株对结核病保护效力的影响。

（2）方法：

首先通过生物信息学分析确定与免疫逃逸相关的三个基因，即BCG_3174、BCG_1782和BCG_2432c，然后通过聚合酶链反应（PCR）和DNA测序在牛分枝杆菌基因组和12种商用BCG亚株中进行确认。通过动物实验比较这三个基因敲除突变株与BCG在体外对自噬效果和保护效力的影响。

（3）结果：

与BCG相比，这三个基因敲除突变株中，BCG_2432c基因敲除突变株（即ΔBCG_2432c）对小鼠结核病模型具有更强的保护效率。ΔBCG_2432c在感染的THP-1细胞中表现出更强的触发细胞内ROS介导的“自噬流”的能力，从而导致更强的抗原呈递效果。这种保护作用的改善可归因于ΔBCG_2432c免疫小鼠脾脏和肺中早期IFN-γ⁺CD4⁺TEM和IL-2⁺CD4⁺TCM细胞的增多。

（4）结论：

BCG的有效性不足是由于重要的自噬抑制基因BCG_2432c阻断了抗原呈递的自噬体-溶酶体途径。ΔBCG_2432c为替代现有的BCG或开发更有效的结核病疫苗提供了一个有希望的策略。

［专家点评］

M. tb感染宿主后引起的细胞自噬，能抑制M. tb在细胞内的生长和增殖，但M. tb也能通过阻断自噬过程中的信号通路，抑制细胞吞噬或细胞凋亡等过程，以避免其被宿主细胞杀灭，甚至利用自噬作用促进其在细胞内进行增殖。细胞自噬过程中涉及大量的细胞内外分子及信号通路，以其中的关键分子及通路作为研究切入点，探索M. tb感染引起细胞自噬的免疫机制，能更好地探索出结核病的防治之策。

点评专家：阳幼荣