第一章　动物感染模型及实验新技术应用

一、结核病肉芽肿的免疫调节图谱

结核肉芽肿的许多病理特征是人类特有的，很难在模型系统中进行复制，然而在结核病中获得活检标本较困难，人体材料的缺乏和高保真模型系统的缺乏阻碍了新疗法的发展。肉芽肿组成高度可变，每个肉芽肿发展轨迹不尽相同，分析组织微环境（microenvironment，ME）中的局部宿主-细菌动态，对于研究肉芽肿结构和免疫细胞的功能尤为重要。

（1）目的：

研究者开发了一种新的研究框架体系，利用有限的患者组织结合公开的转录组数据，借助强大的生物信息学分析方法解析人类活动性结核的免疫学特征。

（2）方法

1）制作南非结核病患者晚期的切除组织和美国的结核病患者尸检肺组织标本的石蜡包埋块。样本采集部位包括肺、胸膜腔、淋巴结、椎骨以及子宫内膜。

2）使用多路离子束飞行时间成像（MIBI-TOF）技术对活动性结核病患者组织中的37种蛋白质进行分析，构建全面的免疫调节图谱，8个空间微环境中映射成19个细胞子集。

3）对健康志愿者和结核病患者的外周血进行转录图谱分析，研究外周血免疫激活情况；进行转录组meta分析，研究免疫调节趋势与肉芽肿成像一致性。

（3）结果：

三组不同临床来源的15个组织样本，分成19个细胞亚群，8种ME。使用FlowSOM进行表型分析，发现肉芽肿中以T细胞和髓系细胞为主，根据不同标志物，髓系细胞又分为巨噬细胞、树突细胞（dendritic cell，DC）和单核细胞。研究者统计γδT细胞占0.1%，CD209⁺DC 占0.2%，调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）占1%，表明该方法能识别丰度较低的细胞群。分析19个细胞群与TB疾病状态之间的关系，发现全面的细胞普查结合免疫细胞频率分析可以揭示不同类型的肉芽肿。

空间富集并量化分析两种标志物如PD-L1和IDO1一起出现的频率，可揭示肉芽肿中空间结构和功能的关联。使用MIBI-TOF16定义的8个空间肉芽肿MEs，揭示肉芽肿中局部免疫调节特征。通过对结核病患者血液转录组的正交分析，发现肉芽肿和外周血的免疫状态同步，二者存在相关性。

（4）结论：

通过新建的通用分析框架，确定了结核肉芽肿中的细胞组成和免疫调节通路与外周免疫反应的关系，对开发靶向宿主的免疫疗法和理解结核病免疫失控的免疫学基础具有重要意义。结核中IDO1和PD-L1等蛋白的表达与肿瘤免疫ME中观察到的免疫逃逸机制一致。基于肉芽肿的多光路成像研究将为结核病控制提供新的思路，通过深入了解肉芽肿局部调控最终如何影响感染结果来控制结核病。

二、gramtools基于基因组图进行多尺度变异分析

基因变异分析是很多研究的基础，本研究开发一种软件gramtools并建立一个模型来处理多尺度变异，不仅基因分型优于现有方法，并且能够对多个交替背景进行基因分型，揭示先前隐藏的基因重组。

（1）目的：

建立一个模型来处理多尺度变异，并开发一个可视化组件框架（visual component framework，VCF）的JSON扩展（jVCF），允许对多个参考进行变异调用，这两者都可在软件gramtools中实现，该软件优于现有的SNP基因分型方法，可对M. tb中重叠了大量的缺失突变的SNP分型，能够在恶性疟原虫的多个替代背景上进行基因分型，揭示先前隐藏的重组。

（2）方法

1）使用vBWT进行图形约束和基因分型：

使用线性化表示的压缩后缀数支持基因组图中的序列搜索，称为变异感知Burrows-Wheeler变换（vBWT）。

2）使用模拟数据验证嵌套基因分型：

基于恶性疟原虫的模拟结果，评估gramtools基因分型，并与SAMtools（经典的“堆积”变体调用者）和Cortex（在de Bruij图中发现气泡）进行比较，然后映射到参考基因中。

3）在替代单倍型上绘制SNP：

确认每个基因的不同形式的小变体，定义一个变体站点和gramtools可支持的图形类型。

4）基因组图构建：

gramtools构建基因组图，无需来自参考基因组的嵌套变异和变体的VCF。

5）构建基因分型模型：

gramtools可进行单倍体和二倍体基因分型。

6）恶性疟原虫二倍体变异分析：

在 gramtools中使用包含4种表面抗原（DBLMSP、DBLMSP2、EBA175、AMA1）的图表对恶性疟原虫基因组图进行基因分型，并使用自定义脚本分析最终的 jVCF。

（3）结果：

gramtools 能实现基因组图构建、基因分型和增强基因组图的工作流程。在此工作流程中，基因分型主要服务于两个用途：首先，通过使用具有此个性化参考基因来发现新变体；其次，gramtools用于已发现变体进行基因分型。因此，相比其他工具，gramtools不仅能实现读取，还能进行精确匹配（在质量修整之后），目前仅限于高精度短片段读取。

（4）结论：

本研究提供了一个在基因组图谱中识别和分型多尺度变异的框架，并展示如何在gramtools中成功实现。与最先进的基因组图工具GraphtTyper2和vg相比，gramtools展现了良好的基因分型性能，还使用多个参考基因提供等位基因二态性分析。

三、利用共变邻域分析法从单细胞转录组学中确定与感兴趣表型相关的细胞群

本研究提出的共变邻域分析（CNA），相比基于集群映射的方法能更灵活无偏倚地识别相关细胞群。CNA通过识别转录空间中的小区域组（被称为邻域）在不同的样本中丰度共同变化，描述了不同样本的主导变异轴，表明共享功能或调节。

（1）目的：

通过构建共变邻域分析（CNA）的方法来分析高维度的单细胞数据集，证明在整个细胞中存在着邻域。在已发表的真实单细胞数据集进行模拟检验，以识别相关细胞群的样本属性，证明它完善并扩展了以前用标准方法发现的关联。

（2）方法

1）构建共变邻域分析（CNA）的算法：

首先创建细胞-细胞相似性图。为数据集中的每个单元格m定义一个邻域，每一个其他单元格m＇都属于锚定于根据从m＇开始的图中的随机行走在s步后到达细胞m的概率。将转录邻域信息汇总成邻域丰度矩阵（NAM），其第n、m项是样本n的细胞在邻域m中的相对丰度。

2）邻域丰度矩阵的构建和质量控制：

选择合适的随机行走的长度S，去除具有强烈批次效应的邻域。以样本级协变量为条件，对NAM进行主成分分析（principal component analysis，PCA），同时对批次和协变量进行调节，进行关联测试。通过在关联测试前将其从NAM 和属性中线性投射出来，来控制样本水平的混杂因素。用模拟来评估CNA的性能，量化校准第一类、第二类错误。

3）使用真实数据集进行验证分析：

在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者和骨关节炎患者的滑膜关节组织的成纤维细胞胞质内小RNA测序（small cytoplasmic RNA sequencing，scRNA-seq）谱中，评估CNA是否能在真实数据中检测出重要的生物结构；在败血症患者和无败血症患者的102 814个外周血单个核细胞（PBMC）的scRNA-seq谱中，评估CNA在有许多细胞类型的数据集中识别细微的病例-对照关系的能力；在结核病队列患者的记忆性T细胞中验证CNA是否应用于一个更大、更丰富的表型数据集。

（3）结果

1）用模拟对CNA进行性能评估：

与基于聚类的传统分析相比，CNA在检测全局整体的基因表达程序（gene expression program，GEP）和特定聚类GEP信号方面具有更强的能力，同时对聚类丰度信号保持了相当的能力；几乎在所有模拟分析情况下CNA都具有更强的信号恢复能力。在较低样本量的TBRU数据的版本中，CNA通常继续优于基于聚类分析。

2）CNA捕捉到涉及类风湿性关节炎的Notch激活梯度：

CNA确定NAM-PC1是该数据集中的主导信号。CNA确定了RA相关的细胞群（全局P=0.02），再现了基于集群的粗略关联，但更精确地反映了驱动Notch机制。CNA在基于集群的关联之外增加了信息的粒度。

3）CNA完善了与败血症相关的血细胞群分析：

CNA发现了相当大的集群内的异质性。15个已发表的集群中有8个包括明显的亚群，与败血症有不同程度甚至不同方向的关联；差异化表达分析将亚群与各自的集群和主要细胞类型进行对比，通过全局分析检测到的许多基因表达程序（如RAC1）将集群中耗竭亚群与非耗竭细胞区分开来，在通路层面，发现几个免疫激活和炎症相关的基因组在这些NAM-PCs中富集，再现了与败血症有关的基因组。

4）CNA捕捉到结核病数据集中的各种关联：

数据集中的NAM-PCs具有生物学意义。NAM-PCs能识别T细胞“先天性”特性，能检测到跨越广泛的细胞类型的细微转录转变，CNA会在无偏倚的mRNA数据中单独识别不同数据模式下关联（全局P=4.5e^-3），以及结核病主要的表型，即两个具有Th17和先天性特征的集群（“C-12”和“C-20”）在结核病进展患者中被耗尽。对单细胞数据（多模态表示）和17个样本级属性之间的关联进行了调查，通过控制混杂因素和多重检验，结果发现年龄（P ＜ 1e^-6）、抽血季节（P ＜ 1e^-6）、遗传血统（P=1.8e^-4）和性别（P=3e^-6）有全面的关联。

（4）结论：

CNA是一种在单细胞数据集中描述丰度变化主轴的方法，并以更大的灵活性和颗粒辨识度识别基因转录丰度与感兴趣样品属性相关的细胞群。CNA与传统的基于聚类的分析相比，提供了更好的功率和信号恢复，同时保持对实验伪影的稳健性，并提供对样品级混杂因素的控制，而且不需要参数调整或长时间的计算。CNA可用于研究不同的样本属性，从而提高对疾病病理学、风险和治疗的理解。除了用于测试与样本级属性的关联外，NAM-PCs本身似乎也具有生物学意义。CNA提供了一个多功能的框架，可以很容易地扩展到其他数据模式。

四、连续血管内染色法测定猕猴白细胞运输动力学

白细胞在全身的运输受到高度调控。监测白细胞的转运能够检测病原体、免疫反应和免疫记忆。疾病中经常发现白细胞运输失调，显示其在内稳态和免疫反应中的重要作用。虽然白细胞转运某些分子的机制已有报道，但对白细胞转运的调控知之甚少。目前，很少有定量评价细胞运输的方法，特别是非人灵长类模型中的检测。

（1）目的：

开发一种连续血管内染色（serial intravascular staining，SIVS）的方法，通过注入荧光标记抗体来标记循环白细胞，测量非人灵长类动物的白细胞运输动力学。

（2）方法：

基于前期小鼠解剖前单次注射荧光结合抗体，区分污染的血管内细胞（IVas⁺，IVas后染色的细胞）和组织停留细胞（IVas^-，IVas后未染色的细胞。通过连续注入不同标记的抗体，识别健康非人灵长类（nonhuman primate，NHP）的血液和组织中不同的动态细胞群，进而使用连续SIVS评估肺、淋巴结白细胞动态运输。

由于抗体注射只标记了血液中的白细胞，细胞在每次注射时的位置被打上“条形码”，提供了位置记录，可以用来推断运输动力学。使用SIVS和多参数流式细胞术来定量稳态下健康动物进入淋巴组织的细胞运输，并识别非淋巴器官特有的血管周细胞。为了研究这些参数在疾病过程中是如何被影响的，以肺肉芽肿中的血管内白细胞为例，SIVS用于定量研究感染M. tb的猕猴淋巴细胞的运输。

（3）结果：

研究发现，SIVS可以示踪NHP中白细胞运输，研究白细胞转运。连续血管内注射αCD45抗体不会严重改变白细胞运输，CD45的输注可识别不同血管内腔室，并辅助淋巴结针刺活检组织（FNA）分析，区分活检细胞中多少比例代表组织来源的细胞，通过排除非淋巴细胞来帮助解释结果。IVas可找到肺肉芽肿中组织内产生细胞因子的细胞，因此SIVS定量肺肉芽肿中的白细胞运输。

通过SIVS对结核肉芽肿研究发现：尽管肺肉芽肿中的大多数细胞停留超过24小时，但肉芽肿是动态的，细胞持续缓慢涌入，其速度预示着M. tb从肉芽肿中清除。

（4）结论：

SIVS结合细胞内染色和多参数流式细胞术，是一种强有力的方法来量化NHP体内白细胞运输动力学，且可用于NHP的结核肉芽肿免疫细胞的动态定量研究。

五、转录调控因子诱导的表型筛选揭示了结核分枝杆菌中的药物增强子

转座子突变策略是研究细菌应激反应的一种强大而客观的方法，但不能完全捕获网络反应的复杂性。为了克服转座子介导的基因突变局限性，研究者开发了转录调控子诱导表型（TRIP）筛选技术，该技术可以量化诱导M. tb单个转录因子的表达。将TRIP筛选与调控网络信息相结合，可以发现复杂的分子反应程序。

（1）目的：

通过TRIP筛选，确定M. tb对一线抗结核药物异烟肼（INH）耐受的新调控网络。

（2）方法：

研究发现调控子被诱导时会改变对INH的敏感性，其中几个调控子不能通过标准的基因突变方法识别。重点研究调控子mce3R，该调控子被诱导时增强INH活性。将mce3R调节的基因与INH的转录反应基线水平进行比较，并将基因ctpD（Rv1469）作为推定的INH效应子，评估ctpD基因在INH耐受中的未知作用。

1）TRIP利用了207株转录因子诱导（TFI）菌株的文库，将TRIP应用于体外M. tb对数期生长，以表征改变基线拟合度的网络扰动。为了验证TRIP检测到的相对丰度差异，将筛选结果与每个TFI菌株在有和没有TFI的1周时间过程中的生长情况进行了比较。

2）在建立M. tb调控网络的表型基线后，应用TRIP研究一线抗结核药物INH的反应。研究代表潜在治疗靶点的规则，mce3R与介导脂肪酸β氧化和脂质转运的基因表达有关，而此前与INH无关。为了验证超敏性，研究者用INH单培养法测试了mce3R诱导菌株（mce3Rind）的生存能力。

（3）结果

1）TRIP检测的表型反映了单株的生长情况；TFI上的显著生长缺陷不常见，且是转录因子特异性的；蛋白质（和转录因子）过表达不表达非特异性生长缺陷。

2）诱导ctpD菌株表达的mce3R在INH处理7天时比单独ctpD菌株表达的菌落形成单位（colony forming unit，CFU）下降更大。结合转录组图谱分析显示结果表明ctpD是mce3R介导的INH激活物调制的主要因素。

（4）结论：

通过结合TRIP和调控网络可以分析改变结核菌对INH反应的基因，TRIP可在任何回复微生物突变的条件下寻找网络介质的适应度，与Tn-seq相比，TRIP需要跟踪的突变集大大减少，因此在技术上易于操作。通过整合调控网络信息，TRIP将有助于深入了解M. tb条件特异性生长表型的突发机制，该策略可以推广到其他生物体。

［专家点评］

本章第一篇研究利用新的多路离子束飞行时间成像（MIBI-TOF）技术，结合强大的生物信息分析能力，使用Deepcell单细胞分割、FlowSOM分析单细胞表型和组成，利用S-LDA发现和分配每个细胞的微环境，从病理组织的全免疫图谱上研究结核肉芽肿的机制。研究者进行了空间富集化分析，量化了两种标志物一起出现的频率。空间性分析揭示了在整体分析水平上无法鉴定到的特征，即肉芽肿中存在空间相互协作的细胞反应。

本章第二篇研究提出在gramtool中识别、调用和输出遗传变异。通过识别位点关系，排他性地对不相容的位点进行基因分型，并与标准参考基因组和本地备用参考基因比较，输出变异结果。gramtools的基因组图模型应用于微生物数据集有3个优势：①在高度多样性的基因中，gramtools基因分型优于基于参考基因组的变异识别；②与基因组图谱工具vg和GraphTyper2相比，gramtools对大缺失和重叠小变异联合的基因分型有更高分型精度；③利用本地备用参考基因对高度分化的小变异体的识别有三个突出特性：兼容性、一致性和可解释性。

本章第三篇研究通过CNA对邻域（转录空间中非常小的区域）进行粒度分析，根据它们在样本中的协方差聚集邻域，解决单细胞数据粒度关联测试的挑战。既提供了数据依赖的、精简的单细胞数据表示法，又提供了功能强大的、准确的关联测试。CNA有几个局限性。第一，CNA的重点在于样本间的变化，其效果和信号恢复会随着样本量的增加而下降。第二，由于其信号类型的方法，在较低的样本量下，CNA可能不如更有约束的模型强大。第三，尽管现有的集群和轨迹的生物注释方法可以分别应用于CNA群体和NAM-PCs，但这些方法通常寻求单一的解释信号；一个相关的群体或NAM-PCs可能捕获多个相关过程，而对于一个特定的生物，这个过程可能被多个NAM-PCs所捕获。第四，CNA的邻域在转录空间中具有概率分布，其相关群体的边界并不总是那么明显。因此，对于具体数据的分析，需要根据研究目的结合方法的优势和局限性来选择。

本章第四篇研究利用SIVS和NHP模型，真实揭示了结核病免疫和肉芽肿病理机制，弥补人群中不能动态活体开展疾病机制研究的缺陷。与以往大动物中定量研究细胞运输的方法不同，SIVS无须进行体外细胞处理，并对细胞逐个区分IVas⁺和IVas-。不过目前SIVS也有局限性。SIVS在NHP中标记血管内白细胞，在动物体内多个时间点将血管内细胞与组织细胞区分开来，并忠实地跟踪血液细胞迁移，促进运输动力学分析。SIVS将细胞内染色和多参数流式细胞术结合，是NHP模型中研究体内细胞运输的一种重要的、可靠的方法。

本章第五篇研究通过结合TRIP筛选技术和网络分析，深入了解结核分枝杆菌条件特异性生长表型的突变机制。转座子介导的基因破坏突变库的筛选是识别候选效应基因的有力工具，但也有局限性：①不能识别上调引发表型的基因；②实验丢失必需基因；③错过多基因协同作用的表型。为了解决基因突变局限性，本研究开发的TRIP筛选有以下优势：①凸显的表型是接近的，因为调控通常包括多个基因，通过进化选择共同调控；②揭示的表型可以用现有的基线调控网络进行解构；③通过化学方法触发转录因子表达，使之能够在特定环境中对刺激产生反馈；④可以评估重要的调控基因和效应基因。因此，TRIP与基于基因干扰的筛选方法是高度互补的。

点评专家：占玲俊