第一节　结核分枝杆菌结构和功能的研究

一、结核分枝杆菌Rv0812对叶酸和肽聚糖生物合成的代谢双功能

结核病仍然是传染病导致死亡的主要原因。关于M. tb特异性生理学的知识仍然不完整。通过生物信息学分析确定Rv0812是吡哆醇-5＇-磷酸（PLP）依赖酶（PLPD）Ⅳ型家族的成员，与参与细胞壁相关D-氨基酸合成的细菌氨基转移酶和参与叶酸前体对氨基苯甲酸（PABA）合成的酶具有几乎同等的同源性。

（1）目的：

了解M. tb Rv0812的结构和功能。

（2）方法：

通过生物化学、代谢组学、结构生物学、生物信息学和化学遗传学方法，测定M. tb重组Rv0812蛋白的生化特性和晶体结构，鉴定与Rv0812 氨基脱氧胆酸裂解酶（ADCL）/D-氨基酸转氨酶（DAAT）双重活性相关的活性位点残基的结构，对Rv0812系统发育进行生物信息学再分析。通过基因敲除技术，构建ΔRv0812突变体，检测其双功能ADCL/DAAT的生理作用。

（3）结果：

M. tb Rv0812编码了一个具有两种酶活性的单一活性位点，一种是参与叶酸生物合成的ADCL，一种是参与肽聚糖生物合成的DAAT。首次发现其底物在该活性位点中竞争性介导核酸和细胞壁生物合成之间的代谢耦合，使PABA优先于D-Ala/D-Glu生物合成。

（4）结论：

M. tb Rv0812的双功能活性揭示了一种新的、酶编码的故障安全机制，可能有助于M. tb和其他细菌的复制和分裂。

二、整体膜酰基转移酶PatA的分子尺机制及界面催化作用

细菌细胞膜不仅在细菌细胞的生理过程中发挥着基本的作用，而且在宿主-病原体的相互作用中也发挥着基本的作用。磷脂和糖脂是细菌细胞膜的基本组成部分，而蛋白质在细菌细胞膜组成中占比较低，但是其与磷脂和糖脂一道在细胞中发挥着一系列不同的关键功能。

（1）目的：

解析整体膜酰基转移酶PatA的分子尺机制及界面催化作用。

（2）方法：

利用表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）、电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）、圆二色性（circular dichroism，CD）、差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）以及结构和分子动力学（structural and molecular dynamics，MD）等方法确定耻垢分枝杆菌PatA的膜关联机制，采用化学合成、酶活性、等温滴定量热法（ITC）和X射线晶体学等方法描述PatA的分子尺机制。

（3）结果：

证明了酰基转移酶PatA在阴离子脂质双分子层中的相互作用和插入是典型的整膜蛋白。这种相互作用方式，以及底物结合位点和催化位点的结构，决定了酶促进不同化学特性分子反应的能力。此外，酶促和结合实验表明，PatA可以通过碳氢标尺机制从不同链长的酰基辅酶A中转移酰基。

（4）结论：

本研究提出了一种界面催化机制，通过使用水溶性酰基辅酶 A 供体，PatA可以酰化锚定在分枝杆菌内膜中的疏水磷脂酰肌醇甘露糖苷（phosphatidyl-myo-inositol mannosides，PIM）。

三、假定跨分枝杆菌外膜分泌管的鉴定及结构解析

M. tb具有厚的细胞壁和复杂结构的包膜层。跨越这些屏障进行蛋白质分泌需依赖于一个特殊的分泌系统，目前关于该分泌系统的信息尚未见报道。

（1）目的：

探索M. tb Rv3705c蛋白和耻垢分枝杆菌MSMEG_6251蛋白的三维结构及其在蛋白分泌过程中的作用。

（2）方法：

通过X射线晶体学和冷冻电镜方法测定M. tb Rv3705c及其在耻垢分枝杆菌中的同源蛋白MSMEG_6251的三维结构，并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和定量质谱法证实该蛋白在分枝杆菌外膜上所发挥的通道作用。

（3）结果：

这两种蛋白质是分枝杆菌细胞膜中的管状蛋白（TiME），形成旋转对称环，两层的TiME环以尾对尾的方式组合成一个环形复合体，然后堆叠在一起形成管状。耻垢分枝杆菌的TiME主要见于细胞壁和细胞膜，敲除TiME基因显著降低了耻垢分枝杆菌培养基中的分泌蛋白量，而该基因在敲除菌株中重新表达能部分恢复分泌蛋白的水平。

（4）结论：

M. tb Rv3705c蛋白和耻垢分枝杆菌MSMEG_6251蛋白在分枝杆菌外膜上形成了一个蛋白质运输管，该发现为针对基于这一结构的抑制剂设计打开了大门。

四、结核分枝杆菌SufR通过其4Fe-4S簇对一氧化氮反应，并调节Fe-S簇的生物发生以在小鼠体内持留

M. tb的持留性是防治结核病的一个主要问题。宿主生成的一氧化氮（NO）被认为是M. tb重编代谢和呼吸以维持持留性的信号之一。然而，M. tb对NO感知和重组的生理机制尚不完全清楚。由于NO会破坏必需酶的铁硫（Fe-S）簇，因此参与调节Fe-S簇生物发生的机制可能有助于M. tb在宿主组织中持续存在。

（1）目的：

研究 M. tb转录因子SufR（Rv1460）的功能。

（2）方法：

应用生化、生物物理和遗传鉴定方法研究SufR的特性和功能。

（3）结果：

证实M. tb SufR包含一个4Fe-4S团簇，通过其4Fe-4S团簇对NO作出反应并直接调节suf操纵子启动子的转录；大气中的O₂和H₂O₂逐渐降解SufR的4Fe-4S团簇；NO通过形成蛋白质结合的二硝基铁二硫醇复合物直接靶向SufR 4Fe-4S簇。SufR直接调控suf操纵子（Rv1460-Rv1466）的表达以对NO作出反应；与此一致的是，M. tb ΔsufR在NO压力下suf 操纵子的调控解除。值得注意的是，NO对Fe-S团簇产生不可逆的损伤，使M. tb ΔsufR的呼吸和氧化还原缓冲能力下降。最后，M. tb ΔsufR不能从NO诱导的非生长状态中恢复，并以NO依赖的方式在免疫激活的巨噬细胞和小鼠肺内显示持续性缺陷。

（4）结论：

SufR是一种NO的传感器，通过重新编程Fe-S簇代谢和生物能量转化实现M. tb的持留。

五、SOS和PafBC在分枝杆菌DNA修复和突变中的分工

DNA修复系统允许微生物在危及染色体完整性的不同环境中生存。像M. tb这样的病原体必须与宿主环境的遗传毒性斗争，宿主环境会产生导致抗生素耐药性的突变。分枝杆菌中，DNA损伤反应（DDR）的一个主要调节因子是可诱导的SOS通路，由LexA抑制因子调控；分枝杆菌还编码第二个DDR通路——PafBC，该通路具有一个转录激活剂的功能。虽然这些通路调控的基因存在一些重要重叠，但它们在生存和突变中的完整功能分工尚不清楚。

（1）目的：

在不同类型的DNA损伤后，通过单独或联合特异性消除SOS和PafBC，与RecA缺失比较，阐明分枝杆菌SOS和PafBC通路是如何在DNA修改和突变中发挥作用的。

（2）方法：

单独或联合特异性消除PafBC或SOS通路；设计LexA-S167A，以避免特异消除SOS后混淆RecA的功能；测试在分枝杆菌DDR中PafBC和SOS通路的转录和功能贡献。

（3）结果：

发现SOS和PafBC系统都是DNA损伤修复所必需的，依据DNA损伤的类型具有不同的重叠的作用，其中SOS在紫外线损伤后发挥主导作用，PafBC在旋转酶抑制后对生存更为重要。最值得注意的是，发现旋转酶抑制和复制叉微小变化可特异性激活PafBC通路，并且共同调控DnaE2/ImuA/B突变体，PafBC和SOS成为染色体突变的共同依赖因素。

（4）结论：

SOS和PafBC通路都对各种DNA损伤条件造成的DNA损伤作出全面有效的反应，在DNA损伤的存活和修复损伤引起的突变中起着重要作用，这两个通路之间的重要差异部分取决于DNA损伤剂的类型。

六、高频溶原化蛋白X作为鸟苷三磷酸酶控制缓慢生长的分枝杆菌在低氧诱导下的复制抑制

高频溶原化蛋白X（HflX）是鸟苷三磷酸酶超家族成员的一种，参与蛋白质的翻译，并且在大肠杆菌等原核生物的热休克胁迫中作为线粒体分离因子结合并分离线粒体亚单位。然而，HflX在低氧环境下致病性M. tb生长中的作用目前尚不清楚。

（1）目的：

揭示HflX在缓慢生长的牛分枝杆菌减毒株卡介苗中的生理性作用。

（2）方法：

对卡介苗野生型、hflX缺失突变型和缺失突变功能补充型菌株进行热休克和低氧压力下的表型、能量状态、药物敏感性、休眠调控蛋白和差异性蛋白表达分析。使用蛋白质组学、基因敲除和核糖体测序等技术手段分析HflX在蛋白质翻译中的作用。

（3）结果：

分枝杆菌的HflX是一种鸟苷三磷酸酶，同时也是控制蛋白翻译的核糖体结合蛋白。在低氧模型的微需氧期，HflX缺陷型卡介苗复制明显加快，进而导致过早地进入休眠状态。HflX缺陷型突变体展现了非复制性分枝杆菌的标志性特征，包括表型耐药，改变的形态，胞内低ATP水平以及休眠调控蛋白的过表达。经鼻感染HflX缺陷型突变株后，在慢性感染期，小鼠肺、脾和淋巴结表现出了增加的细菌载量，与体外微量需氧条件下的高复制率相一致。与快速生长分枝杆菌不同，卡介苗在有氧条件下的生长中，HflX并不参与抗生素抗性的产生。

（4）结论：

卡介苗 Hflx是一种鸟苷三磷酸酶，与M. tb HflX存在100%同源性。在向缺氧过渡期间，HflX与核糖体亚单位相互作用发挥主要的蛋白质翻译调控作用，参与响应缺氧诱导的非复制性状态，从而使M. tb在宿主体内持续存在并成为抗生素表型耐药菌。

［专家点评］

结核病的病原菌M. tb在长期进化过程中已成为能够突破人类宿主屏障，在体内休眠潜伏或增殖生长、致病的胞内寄生菌。然而，至今对决定M. tb致病性的细菌结构、生理功能及与宿主的相互作用的了解尚不全面。M. tb的一些特殊结构尚未被发现，估计1/3～1/2的M. tb基因缺乏功能注释，或部分特异性选择压力相关的功能未被发现，或被错误注释。通过国内外科学家不懈的研究，M. tb结构不断被解析，其功能也逐渐被深入了解，如Black K A等的研究首次发现M. tb Rv0812在抗结核药物靶点叶酸和肽聚糖生物合成途径之间的特定生理联系；Anso I等研究证明PatA是一种完整的膜酰基转移酶，固定在阴离子脂质双分子层上，发挥膜界面催化作用；Cai X等发现M. tb Rv3705c及其耻垢分枝杆菌同源蛋白MSMEG_6251在细胞外膜上形成了一个蛋白质运输的管状结构，使蛋白质分泌能够通过细胞膜和细胞壁屏障；Anand K等发现M. tb SufR是一种NO传感器，通过其Fe-S簇感应NO，调节Fe-S簇的生物发生，使M. tb在小鼠体内持留，该研究阐明了M. tb对NO的反应机制，提出了一种新的M. tb持留模式；Adefisayo O O等的研究为理解经典SOS通路和PafBC通路之间在DNA修复中的分工提供了新视角，也提示临床上广泛使用氟喹诺酮类药物治疗结核病可能促进突变，激活这两个通路，从而增强对其他抗生素的耐药性；Ngan J Y G等的研究将慢生长致病性分枝杆菌的生理功能归因于高度保守的HflX GTP酶，使病原体能够适应其环境。这些结构和功能的发现可能促进结核病新诊断标记物和药物作用新靶点、新药物的研发。

点评专家：吴雪琼