第四节　基因（组）变异解读

一、鉴别遗传性疾病

虽然大部分出生缺陷、先天畸形、罕见病等具有相当高比例的遗传因素，但致病原因还包括许多非遗传因素，如感染、环境毒理、饮食及化学物暴露等可直接致病，也可通过和遗传易感因子互作致病。在临床上鉴别由单一基因及基因组变异引起的遗传性疾病能提高基因检测的临床诊断率，从而间接地降低疾病诊断的成本及缩短医疗周期，因此应受到重视。但要做好这个鉴别不容易，要综合考虑许多因素，临床医生需要对先症者的家族史、孕史（特别需要了解孕期用药、化学物暴露、感染及吸烟酗酒等情况）、家庭社会生活环境全面的了解。尽管许多遗传病有先天性畸形，但并不是先天性畸形就是遗传性疾病。识别非遗传性先天畸形罕见病，如胎儿酒精综合征、海豹肢畸形（由沙利度胺引起）、母源性苯丙酮尿症、寨卡病毒引起的小头畸形、物理性损伤导致的结构畸形等均是临床医生需要掌握的基本能力。

多于一个家庭成员（特别是一级亲属），发生多发性流产、死胎和儿童死亡中出现相同的病症时强烈表明有遗传性疾病。在相对年轻的两个或更多个亲属中发生常见的成人病症（心脏病、癌症、痴呆）家族史也表明有遗传倾向。一些相对常见的临床症状，如发育迟缓/智力落后和先天性多发性畸形已知有较强的遗传因素。通常涉及心脏、面部及生长问题的情况，特别是如果患者同时表达可能为综合征的多个临床特征，如智力迟钝和心脏缺陷，同时有几个脸面部异常表型，如眼距宽或眼睑下垂等也提示有患遗传病的可能。当不能确认时，请遗传学医生进行会诊评估会有帮助。

完整准确地评估临床表型并用统一的标准术语描述记录对于罕见疑难疾病的诊断尤其重要，因对大量基因组变异的分析在很大程度上依靠对基因型-表型相关性的了解。为更好地做好临床表型描述，临床医生可以从遗传疾病知识库（如OMIM、Orphanet、PubMed等）中获得基因、疾病表型等相关知识。

二、选择合适的基因检测方法

遗传病的种类繁多，其突变种类也很多，不同的突变需要用不同的检测手段才能事半功倍。对基因组疾病，传统的染色体芯片能够快速、准确地检测出全基因组范围内的染色体失衡（增加或缺失），特别是自定义高密度芯片能检测出比单外显子还小的拷贝数变异，它在基因组疾病及单基因变异检测中仍然有很大的价值，但随着测序成本的持续下降，WGS能最终替代一般染色体芯片的检测功能，并且扩展到检测非失衡型结构变异如平衡易位、倒位等。对于许多罕见遗传病，特别是与代谢障碍相关的疾病，生化检测一直是特异有效的检测手段，这一技术应用在新生儿的罕见病筛查上充分体现其经济有效和准确快速等优势，对人体代谢谱的分析也正迅速地成为一项常规的临床检测项目，其与分子检测的互补性尤其突出。这一领域在高级质谱技术及大数据分析技术的带引下将得到长足的发展。

目前，NGS主要对绝大多数罕见病做分子（主要是DNA及RNA水平的）检测。基于NGS的分子检测可以根据检测对象的多少分成单基因（single gene）、基因包（gene panel）、临床外显子（clinical exome）、全外显子组（whole exome）及全基因组（whole genome）的检测。在NGS时代，单基因的检测仍很有必要，甚至是必需的，主要应用于以下情况：①临床能明确诊断，致病基因单一的疾病，如神经纤维瘤Ⅰ型（neurofibromatosis typeⅠ）；②致病基因的变异不能为NGS所检测，最常见的包括脆性X染色体FMR1基因中CGG的扩增检测，普瑞德威利-天使综合征（PWS-AS）的甲基化分析等；③NGS结果的验证及对其他家属成员的检测往往使用单基因/位点即可。基因包的检测用于临床有特异表型但遗传异质性较强，需要做分辨诊断的病种较为合适，如肌肉萎缩症（muscular dystrophy）、心肌病（cardiomyopathy），基因包的临床功效在很大程度上取决于临床医生对病种的临床诊断的把握，也取决于已知致病基因能解释这类疾病的比例。因新基因不断被发现，基因包也需不断地更新。临床外显子理论上应当包含所有已知的致病基因，但实际上没有做到，也做不到。一是因为发现新致病基因的速度很快，二是许多曾经认为的致病基因不是或还未得到确凿的证据支持其为致病基因。而全外显子组包含绝大部分编码的区域，但实际内容因公司产品设计不同有很大差别，再加上在测序过程中总有一些区域的覆盖度不够，一部分基因及区域存在高度同源序列和重复序列，目前NGS技术暂未突破这一难关，所以全外显子组总是不全的，这和WES已经取得的临床功效相比，只是一个小小的不足，且将会不断的改进完善。WES除了能检测已知遗传病的序列变异外，新近发现的致病基因也会得到检测，同时还有机会发现新的候选致病基因。因此，有条件时对临床表型复杂、临床表型不特异、临床诊断不明或因患者临床表型还没有展示（如刚出生重症监护室的新生儿）的病例而言，WES是理想的检测手段，也是发现新致病基因的有效策略。目前，WGS已经开始常规性地被用到拷贝数变异（CNV）的分析上，其覆盖度很低（如0.1X）也能检测出全基因组范围内的CNV，且成本不超过目前一般的染色体芯片，但WGS并没有常规用于序列变异的检测，因要检测序列变异，覆盖度要达到30X，这就造成测序的高成本。我们寄希望于新的测序技术终将把我们带入WGS的时代，有机结合全外显子组合中低覆盖度WGS能够满足检测各种变异的需求。

三、基因（组）变异的解读

目前高通量NGS技术正被越来越广泛应用于遗传性疾病的临床分子诊断，但NGS会产生海量的数据，如何在庞大的数据中分析出可靠、有意义的结果，如何正确、合理解读基因（组）变异，使之在临床诊疗中能够有效应用已成为目前最为棘手的问题。美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）制定了基因变异解读指南，建议使用特定标准术语来描述孟德尔疾病（单基因）相关的基因变异，即将变异的临床意义分为五级分类：致病性（pathogenic），可能致病性（likely pathogenic），临床意义不明（variant of undetermined significance，VUS），可能良性（likely benign）和良性（benign）。

该指南提供了两套标准：一是用于对致病或可能致病的证据进行分类（表2-1），二是用于对良性或可能良性的证据进行分类（表2-2）。这些变异的证据包括人群数据库频率、基因变异的类型、基因的功能学研究、以往病例报道、家系成员分离度及计算机功能预测等。致病变异证据可分为非常强（very strong，PVS1）；强（strong，PS1～4）；中 等（moderate，PM1～6）；或 支 持 证 据（supporting，PP1～4）。良性变异证据可分为独立（stand-alone，BA1）、强（strong，BS1～4）或 支 持 证据（BP1～7）。其中，数字只是作为有助于参考的分类标注，不具有任何意义。每个类别中的数字不表示分类的任何差异，仅用来标记以帮助指代不同的规则。对于一个给定的变异，分析人员基于观察的证据来选择标准。根据表2-3的评分规则把标准组合起来进而从5级系统中选择一个分类。

这些规则适用于目前所有的基因（组）变异，无论是基于调查现有案例获得的数据，还是来源于先前公布的数据。分析基因（组）序列变异的临床意义不是一个简单或直接的过程，以前报告的致病变异可能不一定是真的致病性变异，因此变异的临床意义应基于最新的证据进行分析。一些以前分析过的变异在一段时间后或有新的证据出现后需要重新分析，所以这是一项持续性的工作。

（王　剑）