第三章　结直肠肿瘤细胞的生物学特征

第一节　结直肠癌的分子演进过程

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发生是一个多步骤的过程，从正常上皮转变为腺瘤中间体，最终发展为腺瘤是多种遗传事件共同作用的结果。Fearon和Vogelstein提出CRC的发生是癌基因的激活突变和抑癌基因的失活突变共同作用的结果，且恶性肿瘤的形成至少需要4～5个突变。癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）对97例CRC患者进行的低丰度全基因组测序结果表明，16%的CRC样本是高突变的，并且其中3/4携带有高甲基化和MLH1沉默相关的MSI，1/4表现为体细胞错配修复基因和聚合酶ε（POLE）突变。常见的突变基因包括APC、P53、SMAD4、PIK3CA、KRAS、SOX9、FAM123B和ARID1A。

一、遗传改变

（一）癌基因

RAS是一类被称为GTP酶的蛋白，在人类大多数细胞中均有表达，其主要功能是细胞内信号转导，控制细胞增殖、细胞分化、细胞黏附、细胞凋亡和细胞迁移等过程。RAS突变时，促进细胞侵袭和转移。Vogelstein等首次发现CRC中存在RAS基因突变。RAS突变是CRC中的一个重要的体细胞突变，RAS家族主要是KRAS突变。在发生转移的CRC样本中，约40%的CRC样本携带KRAS突变，主要发生在2号外显子的12（70%～80%）和13（15%～20%）位密码子。此外，3号外显子的59～61位密码子和4号外显子的117和146位密码子也可能发生KRAS突变。在2号外显子中，突变常见于密码子12：G12D、G12V和G12C，在3号外显子中突变的密码子为Q61H和Q61R，4号外显子中突变的密码子为A146T和A146V。RAS基因突变可能是结肠癌发生的启动事件。除了RAS这种点突变，癌基因还可通过扩增或重排被激活。研究发现在原发性CRC及其衍生细胞系中存在neu、c-myc或c-myb扩增。

BRAF参与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路激活，促进细胞生长、增殖和分化，在细胞迁移、凋亡和生存中也发挥重要作用。约90%的BRAF突变发生在第15号外显子T1799位点上（V600E）。这种颠换通过调节磷酸化，使BRAF活性比WT提高约10倍。BRAF突变的CRC患者是一群小而独特的群体，占所有CRC患者的8%～12%。约60%的BRAF突变肿瘤是低分化的，只有36%的BRAF突变肿瘤是高或中度分化的。黏液亚型肿瘤与BRAF突变的相关性更高（22%～67%）。不同于大多数CRC，BRAF突变的CRC更常发生腹膜转移，较少发生肺和肝脏转移。BRAF突变和肿瘤中某些分子的相关性已被研究。BRAF和KRAS突变是互斥的，而13%的CRC患者中同时存在BRAF和PIK3CA突变，22%的CRC中发现BRAF和PTEN共突变。BRAF V600E突变在高MSI患者（38.9%）中的发生率高于低MSI患者（9.3%）。BRAF突变与转移性CRC患者的预后负相关。

（二）抑癌基因

在CRC中，经常发生特定染色体区域的丢失。这种丢失通常发生在正常细胞的两条亲本染色体中的一条，该丢失区域通常含有抑制生长和分化的抑癌基因。CRC中的染色体丢失首次通过细胞遗传学方法被发现，后来研究者通过探针检测限制性片段长度多态性，确定两个亲本等位基因中是否有一个在肿瘤DNA中特异性丢失。CRC形成的遗传易感性发生在常染色体显性综合征和家族性腺瘤性息肉病。家族性腺瘤性息肉病的基因座已被定位到5q染色体。在无息肉病的患者中，有20%～50%的CRC和约30%的结直肠腺瘤存在5q染色体的等位基因丢失。不过，在家族性腺瘤性息肉病患者的腺瘤中，5q染色体的等位基因丢失是罕见的。超过75%的CRC中存在17p染色体的大片段丢失，但这种染色体缺失在各阶段的腺瘤中均相对少见。此外，研究发现在一些患者中，17p等位基因的丢失与腺瘤到癌的进展有关。CRC 17p染色体最常见的缺失区域包含P53基因。P53基因的一个等位基因点突变加上另一个野生型等位基因的丢失在CRC中频繁发生。此外，越来越多的研究发现，野生型P53可以抑制结肠癌的生长。CRC中第二常见的等位基因丢失位置是染色体18q，该丢失存在于超过70%的癌变和近50%的晚期腺瘤。在18q染色体上发现了共同的缺失区域，并且该区域存在抑癌基因——结肠癌缺失基因（deleted in colon cancer，DCC），该基因编码与细胞黏附家族分子高度同源的蛋白质。DCC基因在正常的结肠黏膜中表达，而在大部分CRC中低表达或不表达。这些表达缺失在某些情况下与DCC基因的体细胞突变有关。18q染色体上DCC基因位点的丢失，可导致遗传性非息肉病性CRC的易感性。APC基因在家族性腺瘤性息肉病和散发性CRC中的突变是一个关键的早期事件。除了上述提到的染色体5q、17p和18q等位基因丢失，在CRC中还存在1q、4p、6p、6q、8p、9q和22q染色体部分区域的丢失。

（三）其他改变

除了基因突变和染色体特定区域丢失，在CRC中还存在一些其他改变，如ERBB2和IGF2的基因组扩增，NAV2和TCF7L1的融合，以及myc介导的转录激活或抑制。此外，肿瘤免疫微环境对CRC的发生也至关重要。高突变微卫星高度不稳定肿瘤表现出一种新抗原触发的细胞毒性免疫浸润，这有助于其对免疫治疗的反应性。然而，大量低突变负荷的结直肠癌似乎通过不明确的机制表现出激活的免疫微环境。

CRC中至少存在4种基因组或者表观遗传学不稳定性改变，分别是MSI、染色体不稳定（chromosomal instability，CIN）、CpG岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）和广泛低甲基化。其中CIMP和广泛低甲基化详见本章第七节，本节重点介绍CIN和MSI。

二、分子演进主要途径

（一）CIN途径

基因组不稳定的最常见形式是CIN，超过85%的CRC中存在CIN。CIN是指染色体的数量异常或多重结构畸变。引起CIN的机制主要有如下三种：①由于监测染色体分离的信号通路缺陷所致。有丝分裂检测点是细胞周期的主要调控机制，它通过延迟分裂确保染色体分离的高保真度，直至所有染色单体对都正确地排列在中期板上。检测点信号的缺陷导致染色体错误分离和随后的非整倍体，异常数目的染色体分布到子细胞。②端粒功能障碍可驱动CIN，端粒是DNA-蛋白质复合物，由六聚体重复序列（人类的TTAGGG）组成，在染色体分离过程中保护真核生物染色体的末端不发生融合和断裂，当端粒末端保护受损时，染色体末端进入断裂-融合-桥循环，可以持续多代细胞，并导致基因组重组。③ DNA损伤反应。机体通过级联反应介导细胞周期阻滞来修复DNA损伤，在损伤无法修复的情况下，则诱导细胞衰老或凋亡。一些DNA修复蛋白参与人类癌症。一项体内研究证实DNA损伤反应和CIN直接相关。组蛋白H2AX是ATM和ATR的底物，单倍剂量不足可导致基因组不完整。

（二）MSI途径

微卫星DNA是指基因组的一类短串联重复序列，几乎存在于各种生物的基因组中。MSI指由于插入或缺失突变引起的微卫星序列长度改变的现象。MSI存在于约15%的转移型结肠癌中。目前，许多临床实验室使用5种单核苷酸标记（BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27）评估MSI，这些检测方法均具有较高的灵敏度和特异度。携带MSI的结肠癌患者比携带CIN的结肠癌患者预后好，MSI和CIN通常是互斥的，几乎不会同时存在于同一种肿瘤。

MSI的潜在机制研究已经较为清楚，主要是由于DNA错配修复中的（MMR家族）基因失活，可能是通过CIMP引发启动子甲基化失活，也可能是通过体细胞突变失活。此外，林奇综合征（遗传性非息肉病性CRC）患者几乎完全发展为MSI CRC，因为他们携带有MMR基因的生殖系突变，包括MLH1、MSH2、MSH6和PSM2。相反，散发性MSI CRC通常由于异常甲基化导致MLH1沉默进而导致MMR活性丧失。现在的研究发现，散发性MSI肿瘤与锯齿状瘤形成途径有关，通常携带BRAF V600E突变，而MMR基因（林奇综合征）生殖系突变导致的癌症没有BRAF突变。

三、分子演进主要模型

（一）正常上皮-腺瘤-腺癌的多阶段基因假说模型

CRC分子演进过程中的最经典模型是正常上皮-腺瘤-腺癌的多阶段基因假说模型，该模型于1990年由Fearon和Vogelstein提出，约85%的CRC由该演进过程形成。首先，APC抑癌基因失活导致异常隐窝灶形成，随后染色体18q杂合性缺失，KRAS、P53基因突变等CIN事件和基因突变的累积驱动腺瘤形成、进展、癌变（图3-1-1）。

肿瘤发生需经过一系列的基因改变，其中包括癌基因（RAS）和抑癌基因（特别是5q、17p和18q染色体上的基因）。5q突变或FAP丢失是CRC发生的早期事件，随之是甲基化改变，KRAS突变紧随其后，接着是18q丢失，最后是17p丢失。

Chen B等通过单细胞RNA-Seq、多重免疫荧光和多重免疫组织化学绘制了两种人类最常见的CRC息肉-常规腺瘤和锯齿状息肉的单细胞转录组图谱和成像图谱。他们发现传统腺瘤中干细胞标志物OLFM4和SOX9高表达，且LGR5、OLFM4、ASCL2、AXIN2、RNF43和EPHB2等Wnt通路相关基因被激活，是由Wnt通路驱动干细胞扩张而产生。而锯齿状息肉高表达MUC5AC，其形成的原因可能是肠腔表面反复刺激导致细胞化生进一步形成，而非隐窝起源。

除了经典的“正常上皮-腺瘤-腺癌的多阶段基因假说模型”，通过基因组学分析，对比同一患者身上的原发性肿瘤和转移灶，又提出5种肿瘤向转移发展模式模型（图3-1-2）：线性进化、“大爆炸”模型、合作进化、克隆选择、转移特异性突变。

（二）线性演进

线性进化是指肿瘤由最初的分子特征所决定的路线进行演化。这些分子特征包括驱动突变、转录活性情况、组成原发性肿瘤的细胞类型等。这意味着肿瘤最初的突变决定了它是否会向着转移发展，而后续发生的突变影响都是十分有限的。这样，肿瘤的发展情况从一开始就是可以预测的。

（三）“大爆炸”模型

“大爆炸”模型是指正常组织在转化为肿瘤后，会经历一个高度的基因组不稳定阶段，产生具有各种分子变异的克隆细胞群体，形成高度的肿瘤异质性。在之后肿瘤的发展过程中，部分亚克隆群体稳定下来并且相对平稳发展，从而形成高度异质的原发癌，并形成转移。在这一模型中，肿瘤的转移仍是可预测的。

（四）合作进化

合作进化认为肿瘤转移的形成并不是某一突变类型的肿瘤细胞就能够形成的，而是需要有多种具有不同分子变异的原发癌亚群共同实现转移性的获得。对于合作进化，特定的突变类型组合形成转移仍是可以确定的，因此肿瘤是否会形成转移仍是可以预测的。

（五）克隆选择

克隆选择则更多地关注单细胞的变异，认为肿瘤中各种克隆群体中一个或几个具有额外突变的单细胞克隆被正向选择，并且相对于肿瘤主体细胞克隆群体的分子组成，这些获得额外突变的单细胞克隆独立地向转移发展并最终形成转移。基于该模式，单细胞层次的分析仍能预测肿瘤转移形成的可能性。

（六）转移特异性突变

转移特异性突变认为肿瘤初始的传播是由原发性肿瘤的变异所决定的，这些突变的肿瘤细胞在初始传播后又获得额外的突变，从而导致肿瘤的微转移形成临床上明显可见的转移性肿瘤。即转移决定性的变异是在脱离原发性肿瘤后获得的，基于这一点，肿瘤转移性是无法通过分析原发性肿瘤的基因情况来获得的。

CRC从非典型增生发展为原发癌，侵袭周围组织，最终转移到淋巴结和远端组织。这些模型对通过分析原发肿瘤预测远处转移的可能性做出不同的说明。①线性进化：初始驱动突变决定转移风险，额外突变对转移风险影响有限；②大爆炸模型：在转化后，产生具有各种分子病变的克隆，一些克隆向转移方向线性进化；③协同进化：具有不同分子病变的原发癌需要不同亚群来完成转移；④克隆选择：经典的肿瘤进化模型预测原位癌中获得额外突变的亚克隆的选择，连续的癌变步骤需要额外的突变来提供选择性优势；⑤转移特异性突变：最初的播散是由原发癌中存在的突变决定的，在播散后获得额外的突变，使微转移成长为临床上明显的转移肿块。

这些模型有可能同时存在。原发性肿瘤的驱动突变可能会决定肿瘤是否向转移发展，但是原发性肿瘤中不存在或只存在于某一亚群中的额外基因也可能会对转移的发生产生影响，只是这些额外基因的变化可能会因驱动突变的不同而变化。另外也有报道发现具有不同突变的细胞在至少一个转移形成步骤中合作的模式，这与合作进化模型一致。

值得一提的是，对人类癌症的深度测序支持“大爆炸”模型。“大爆炸”模型关注肿瘤细胞演化时分支突变是否改变该分支继续向转移方向演化的潜力。基于甲基化模式的腺瘤隐窝系谱分析指出多数克隆出现在腺瘤发展的早期，形成高度的瘤内异质性，而克隆的稳定性随着时间提升。CRC基因组分析也指出多数变异，都是在致癌早期形成的，并且这些变异会在肿瘤形成的过程中缓慢均匀地分布到整个肿瘤中。这些都符合“大爆炸”模型的肿瘤演化模式。

这样的“大爆炸”模型意味着在肿瘤发展的早期大量异质亚克隆群体产生，然后与复制出错相关的突变连续积累。肿瘤发展后期出现的变化只存在于肿瘤的小区域。肿瘤转移的潜能也在肿瘤发展较早的时期就已经决定。在早期产生的一些克隆克服了基因不稳定，并成长为晚期肿瘤以及形成转移灶。因此，大爆炸模型通过突出分支事件的时间结合了分支模型。基于这样的模式，转移灶和原发灶会有许多一致的突变，而某一个细胞亚群中某些突变的缺失意味着这个亚群可能是转移灶的祖细胞。

也有研究指出并非所有细胞都存在原发性肿瘤带有的突变。在他们的研究中观察到在转移细胞中KRAS的流行率最高，达到56.9%。这样的观察结果比较难以融入线性进化模型中。这一研究成果意味着由多种细胞组成的转移瘤可能来自不携带突变基因的原发肿瘤而在转移处获得新的突变。这一研究成果可能需要通过转移特异性突变模型或合作转移模型予以解释。

CRC显示出明显的形态学演变，从腺瘤上的异常隐窝病灶到浸润性癌和转移，但这种演变的分子相关性不是线性的，而是呈现分支性的。CRC的形成主要由于基因组不稳定，原癌基因的驱动突变可能对肿瘤的发展和转移起重要作用，肿瘤发展过程中额外的基因突变对肿瘤演化的贡献尚不明确，但是其影响很可能有限。

在众多肿瘤演化模型中，“大爆炸”模型较好地解释了CRC的突变模式。在肿瘤形成的早期获得众多突变克隆群体，表现高度的瘤内异质性。随后部分克隆群体稳定下来，并经历一个相对平稳的生长阶段。原发性肿瘤已经拥有肿瘤进化的大部分决定因素，这与通过分析原发性肿瘤来预测结果的可能性一致。后来发生的乘客突变、个体突变只是有限的拓展。

（周天华　刘祥瑞）