第五章　结直肠癌转移的分子机制

第一节　原发肿瘤与转移

一、结直肠癌转移途径和转移部位

结直肠癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。转移是限制结直肠癌临床疗效的重要因素，也是导致结直肠癌患者死亡的最主要原因。约有20%的患者在初始诊断时便已发现存在远处转移，另有25%～50%的患者在根治术后出现远处转移。

结直肠癌主要通过三种主要方式转移到远处器官：①血行转移至肝、肺、脑、骨等其他组织脏器；②淋巴转移；③种植转移，主要包括腹膜转移和卵巢转移。结直肠癌最常见的远处转移部位是肝、肺、腹膜，其中肝转移占40%～50%，肺转移占10%～20%，腹膜种植转移占7%～15%。此外，结直肠癌还可以转移至卵巢、肾上腺、骨和脑。转移性结直肠癌的预后差，5年生存率仅约14%。

二、结直肠癌的侵袭-转移级联过程

肿瘤转移是一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的侵袭-转移级联过程，其间发生了一系列分子事件，包括：①原发肿瘤自然生长并获得侵袭性；②肿瘤细胞从原发灶脱落，降解周围的细胞外基质；③侵犯邻近组织，渗入新生血管和淋巴管；④通过脉管系统运输，在转移部位的毛细血管床中停留；⑤血管外渗；⑥在转移器官建立微转移灶，或长时间处于休眠状态；⑦生长增殖形成大转移/继发性肿瘤灶，最终在远处形成转移灶。侵袭-转移级联过程的每一个阶段都会形成一个至多个生理屏障。为了成功转移，肿瘤细胞必须克服所有屏障，形成隐匿性微小转移灶，并最终在附着部位获得增殖能力，形成肉眼可见的转移瘤。侵袭-转移级联过程中复杂的细胞生物学事件受肿瘤细胞自身的遗传学和/或表观遗传学调控，肿瘤细胞和非肿瘤性基质细胞之间的相互作用在整个侵袭-转移级联过程中也起着至关重要的作用。

由于结直肠癌与其他肿瘤组织来源、遗传背景及癌变机制不同，因此，其转移的分子机制与其他肿瘤相比既有共性，也有其特殊性。经典的“腺瘤-癌变”学说认为，从正常结直肠上皮到异常增生、腺瘤、癌变及癌的侵袭和转移，先后发生了一系列基因的突变、错配、癌基因激活及抑癌基因失活，这些突变包括：腺瘤性结肠息肉病肿瘤抑制蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）或β联蛋白（β-catenin）突变，Wnt途径被激活，从而导致结肠直肠肿瘤发生；正常细胞恶性转化的过程中同时伴有KRAS基因突变激活、PI3K信号通路激活、TP53基因突变和失活、TGF-β信号通路活性等。一旦癌细胞突破了结肠壁，肿瘤就可以迅速转移到远处器官。

三、侵袭-转移级联过程的调控机制

（一）局部浸润

1.细胞黏附力下降

肿瘤侵袭的第一步是肿瘤细胞从原发灶脱落与游离，这一步骤主要由于肿瘤细胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAM）异常和黏附力下降所导致。CAM是细胞膜上的一类跨膜糖蛋白，主要包括黏附素家族、整合素家族、选择素家族、免疫球蛋白超家族、透明质酸受体，以及其他一些未定类的黏附分子。在实体肿瘤中，黏附分子介导肿瘤细胞间的连接以及肿瘤细胞与间质成分之间的连接，后者包括基底膜、细胞外基质、血管内皮细胞、成纤维细胞、白细胞、血小板等。黏附分子的异常直接导致肿瘤细胞的黏附力下降，在侵袭和转移中发挥极为重要的作用。在结直肠癌中，与细胞基质完整性相关的Lama3、Lama5分子及细胞黏附力相关的整合素家族（包括a2、a5b1、a6b1、a6b4、a2b1整合素）、癌胚抗原分子、选择蛋白、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等均被证实与肿瘤转移相关。

（1）钙黏着蛋白超家族：

钙黏着蛋白是一种跨膜糖蛋白家族，为一类钙依赖性的蛋白分子，主要参与同源细胞间的连接，分为E-钙黏着蛋白（主要存在于表皮组织中）、N-钙黏着蛋白（存在于神经组织中）、P-钙黏着蛋白（主要存在于胎盘）。E-钙黏着蛋白是存在于上皮组织中的钙依赖性单次跨膜糖蛋白，介导同型细胞间的黏附。E-钙黏着蛋白由胞外段、跨膜区和胞内段组成，其胞内段与β联蛋白相连，β联蛋白又经α联蛋白介导和细胞骨架蛋白（微管和微丝）相互作用，共同形成上皮细胞间稳定的黏附连接。E-钙黏着蛋白表达下调或表达异位是癌细胞离散的分子基础，其表达降低与CDH1基因突变或缺失、DNA甲基化、转录抑制、蛋白水解等因素有关。此外，由于各种因素导致的β联蛋白磷酸化可以使E-钙黏着蛋白/β联蛋白复合体稳定性下降，从而促使E-钙黏着蛋白介导的黏附能力下降，导致肿瘤细胞间连接松散，易于迁移和转移。在结直肠癌中，侵袭前沿的肿瘤细胞内也发现β联蛋白磷酸化水平增加、细胞膜E-钙黏着蛋白丧失及β联蛋白核聚集的现象。

（2）整合素：

整合素蛋白是普遍存在于细胞表面的异二聚体跨膜糖蛋白受体，这些跨膜蛋白由2个亚单位组成，称为α亚单位和β亚单位，至少有14种α亚单位和8种β亚单位。α亚单位和β亚单位以非共价结合方式形成复合物，多种组合产生了超过20种不同的整合素。整合素家族蛋白有一个较大的胞外段、一个跨膜段和一个胞内段，具有跨膜针对细胞内和细胞外两个方向传递信号的能力。整合素胞外段结合配体（细胞外基质或细胞表面黏附分子），胞内段通过结合肌动蛋白、纽蛋白、踝蛋白（talin）与细胞骨架相连，形成配体-整合素-细胞骨架跨膜信息系统，即黏着斑。整合素广泛参与细胞形态和极性、基因表达、细胞存活与增殖、细胞迁移，以及细胞外基质重塑和肿瘤侵袭转移的调控。

整合素β1是整合素家族中最大的亚群。整合素β1可以通过结合不同的配体激活不同的下游信号通路，从而介导肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖，抑制肿瘤细胞的凋亡；并且能够通过促进肿瘤血管及淋巴管的生成，促进肿瘤的发生和转移；同时，整合素β1可以通过多种途径增强肿瘤细胞耐药性及失巢凋亡抗性，影响恶性肿瘤的药物治疗，促进肿瘤转移灶的形成。整合素β1作为恶性肿瘤的潜在治疗靶点，相关作用机制的研究对探索肿瘤的发生、发展及转移具有重要意义。

2.上皮-间充质转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及其调控机制

EMT指在一些生理或病理因素的作用下，极性上皮细胞失去极性，转变为具有间充质细胞形态和游走迁徙能力的细胞的可逆性过程。EMT的典型特征包括：①形态改变，即细胞形态由鹅卵石样转变为纺锤体样，细胞极性丧失，细胞骨架重建；②分子标志物改变，细胞上皮标志物如E-钙黏着蛋白、闭合蛋白、ZO-1、黏附分子、细胞角蛋白、联蛋白等表达下调或丧失，间质化分子标志物如N钙黏着蛋白、波形蛋白、纤维连接蛋白等表达升高；③生物学行为改变，即黏附力下降、细胞迁移和运动能力增强。EMT使本来不具有侵袭性或非转移性的肿瘤细胞获得侵袭性，是上皮性肿瘤进展过程的重要步骤。EMT是可逆的，其逆转过程为间充质-上皮转换（mesenchymal-epithelial transition，MET），MET是肿瘤在远处发生定植的重要因素。在结直肠癌中，EMT表现为组织学上观察到的“肿瘤芽”。

EMT过程受到多种因子的协同调控，包括EMT诱导因子、EMT调节因子和EMT效应因子，由EMT诱导因子介导的信号通路与相关转录因子共同组成一个复杂的调控网络。EMT诱导因子主要包括肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、表皮生长因子、TGF-β、胰岛素样生长因子、VEGF、Wnt及NOTCH等。EMT调节因子包括SNAI1/SLUG家族、ZEB1/2、TWIST1/2、核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）、SIP1、E12/E47等转录因子。这些转录因子能与DNA启动子区E-box基序结合，从而抑制靶基因转录。除了抑制E-钙黏着蛋白的表达，SNAI1和SLUG还与激活间充质基因（如波形蛋白）表达所需的多种途径相互作用，如N-钙黏着蛋白和纤维连接蛋白。SLUG过表达也可诱导其他EMT调节因子的表达，如ZEB1和ZEB2。ZEB1和ZEB2通过直接结合E-钙黏着蛋白编码基因CDH1启动子区域的E-box基序，或间接募集共阻遏分子的C端结合蛋白来调控EMT，导致E-钙黏着蛋白表达下调，从而诱导EMT。在结直肠癌中，ZEB1/2还可上调SOX2、KLF4和Bmi1来诱导EMT和干细胞特性。N-钙黏着蛋白的表达则可以通过促进RAC1、RHO、CDC42信号介导的片状伪足和丝状伪足形成，诱导EMT。

Wnt通路：超过80%的结直肠癌具有APC基因突变，因此，Wnt信号通路普遍激活，在肿瘤侵袭前沿尤为显著，表现为β联蛋白核转位和细胞膜E-钙黏着蛋白丧失或下调。经典的Wnt/β联蛋白信号通路由细胞外的Wnt蛋白、膜受体卷曲蛋白、CK1、Dsh/Dvl、GSK3β、APC、Axin、β联蛋白及转录因子TCF/LEF家族组成。Wnt蛋白与膜受体卷曲蛋白结合后，可激活Dsh/Dvl蛋白，进而抑制GSK3β/APC/Axin复合物对β联蛋白的磷酸化，保护其不被降解，导致β联蛋白在细胞质内聚集，并且入细胞核与转录因子TCF/LEF结合，形成转录因子复合物，促进下游靶基因转录。Wnt通路的下游靶基因数量众多，广泛参与胚胎发育、细胞分化、增殖生长等多个生物学过程，在肿瘤发生发展及转移中也起重要作用。Wnt/β联蛋白通路的激活也能诱导EMT调节因子如ZEB1和TWIST的表达，从而诱导EMT。

TGF-β/Smad通路：TGF-β是在发育、分化、损伤修复、癌症等病理状态下诱导EMT最重要的生长因子之一。在体外培养的上皮细胞系中，单纯的TGF-β刺激就可以诱导EMT。SMAD依赖的经典通路是TGF-β信号转导并诱导EMT的核心部分。在经典通路中，TGF-β通过转化生长因子-βI型受体（transforming growth factor-β receptor Ⅰ，TGF-βRⅠ）和Ⅱ型受体（TGF-βRⅡ）触发信号转导，这两种受体都是跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体。与TGF-β结合后，TGF-βRⅡ招募并磷酸化TGF-βRⅠ的胞内结构域，形成异四聚体，随后磷酸化并激活SMAD蛋白。磷酸化的SMAD2/3与受体分离并与SMAD4形成异源三聚体结构，然后转移到细胞核内与转录因子和辅因子结合，激活或抑制下游靶基因的转录。除SMAD依赖的通路外，TGF-β还可通过非SMAD依赖的通路调控EMT。TGF-β可通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）途径，激活下游的胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK），从而诱导EMT。Wnt通路也能与TGF-β/SMAD通路交互对话，上调EMT调节因子SNAI1和TWIST，抑制钙黏着蛋白表达，并激活β联蛋白/TCF/LEF转录复合物，间接导致波形蛋白等间质标志物的表达，共同调节EMT进程。在早期肿瘤中，TGF-β通路激活可促进细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖。而在肿瘤进展的晚期阶段，TGF-β通路激活可诱导EMT、新血管生成、免疫逃避、细胞运动和迁移，从而促进肿瘤转移。在结直肠癌中，TGF-β通路激活与肿瘤转移密切相关。

此外，在结直肠癌中，Notch1介导的Notch信号可以上调Jagged1，从而促进CD44、Slug和Smad3表达，进而诱导EMT。在结直肠癌中广泛激活的KRAS信号也可以与TGF-β信号通路相互作用，激活转录因子如NF-κB和Snail，从而诱导EMT。非编码RNA如miRNA和lncRNA在EMT及其信号通路的调控中也起着相当重要的作用。miRNA是一类长度为19～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，其与目标mRNA配对，导致目标mRNA发生降解，或者抑制靶mRNA翻译，从而在转录后水平调控基因表达。研究发现，miRNA-200家族（包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-429和miR-141）、miRNA-103/107等多种miRNA参与调控EMT的过程。miR-200家族驱动上皮细胞分化，可以直接上调E-钙黏着蛋白的表达，也可以通过抑制ZEB1/2的表达从而间接抑制上调E-钙黏着蛋白的表达。ZEB1/2可抑制miRNA-200家族成员的表达，两者形成负反馈回路。这种负反馈调控回路也存在于结直肠癌中，协同调节EMT和肿瘤侵袭转移。

3.集体细胞侵袭

侵袭性肿瘤细胞可以以单个细胞形式发生迁移，也可以成片、成簇发生迁移，后者称为“集群迁移”或“集体细胞侵袭”，集体迁移的癌细胞簇比单个细胞具有更高的转移倾向。在转移过程中，成簇的癌细胞保留了上皮特征，但位于癌细胞簇前端的前驱细胞则具有间质细胞特征。这种转移性癌细胞簇在癌症患者的血液和淋巴管系统中均可检测到，在乳腺癌、结肠癌和肺癌等组织中也被观察到，表现为原发肿瘤周围间质区域中的簇状、片状肿瘤细胞。

作为播散性细胞群，转移性癌细胞簇具有较完整的细胞间和细胞与细胞外基质的连接，包括黏附连接、紧密连接、桥粒连接、间隙连接。黏附连接负责调控组装和维持细胞-细胞黏附、稳定肌动蛋白细胞骨架，并通过下游信号通路参与转录调节。紧密连接则位于静态单层和迁移上皮细胞顶端，充当膜内“栅栏”将顶端细胞膜和基底外侧细胞膜蛋白隔开，还可作为疏水性屏障调节离子、蛋白质和液体的跨上皮运输和跨内皮运输。桥粒是一种坚韧、牢固的细胞连接结构，使相邻的细胞连接成一体，并可以承受很大的拉力，使得细胞间连接更为牢固。在部分癌症中，桥粒可能在肿瘤侵袭期间保持功能，如结直肠肿瘤，两种类型的桥连蛋白均异常高表达。间隙连接是连接相邻细胞胞质的跨膜通道，每个细胞与由六种蛋白形成的半通道连接，称为连接蛋白，介导细胞-细胞识别和细胞间对接。作为细胞间通信的中心介质，间隙连接长期以来一直与癌症转移、伤口愈合和形态发生过程中集体细胞迁移的调节有关。在癌症进展的不同阶段，间隙连接可能选择性地调节从单个细胞迁移到集体细胞迁移的转变。

与单细胞迁移相似，集体迁移的过程也经历了癌细胞（或癌细胞簇）突出、极化、收缩和黏附到周围基质的过程。集体迁移同时还维持着组织凝聚性，调节组织旁细胞通透性；并产生大量可溶性因子，在特定的可移动和非移动细胞间进行分配；同时，还可通过细胞-细胞间连接传导信号，保护播散性癌细胞簇免受免疫攻击。为了在前面拉动细胞并在后面推动细胞，牵引力的产生至关重要，这是通过存在于前驱细胞中的整合素来完成的。例如，前驱细胞中，与胶原蛋白结合的整合素α2β1以及与纤维蛋白结合的整合素αvβ3异常高表达，整合素α2β1和整合素αvβ3通过黏着斑复合物使其附着在纤维连接蛋白等细胞外基质成分上。位于前驱细胞后方的细胞则形成片状伪足，其整合素α6β1附着在基底膜上。整合素与细胞外基质的结合导致细胞骨架变化，收缩蛋白、踝蛋白、桩蛋白（paxillin）和黏着斑蛋白（vinculin）等细胞骨架衔接蛋白激活，肌动蛋白重组，进而形成丝状伪足，这一过程受RAC1、CDC42、RhoA等分子的精细调节。

细胞外基质降解和重塑对于集群细胞的迁移至关重要。前驱细胞分泌MMP14［膜型基质金属蛋白酶-1（memberane type-1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP）］降解其周围的细胞外基质，为转移细胞簇的迁移打开初始裂口，紧随其后的细胞继续降解细胞外基质，并产生层粘连蛋白、串珠蛋白聚糖、巢蛋白1和Ⅳ型胶原对细胞外基质进行重建。

4.细胞外基质降解和重塑

细胞外基质是由细胞合成并分泌到胞外的多种大分子蛋白构成的网络结构，由胶原蛋白、蛋白聚糖、弹性蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等分子组成。一般而言，细胞外基质由位于基底膜和细胞间质的基质组成。间质基质在细胞周围形成多孔的三维网络，这些网络将基质中的细胞相互连接，并可以连接到基底膜。间质基质成分主要包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅴ型胶原蛋白，纤维连接蛋白和弹性蛋白，其功能是保证组织和器官的结构完整性，也可介导信号转导通路，参与调节细胞分化和迁移等过程。癌症中，间质基质重塑会引起广泛的物理和生化变化，包括细胞信号转导、细胞外基质刚度变化、细胞迁移和肿瘤进展等。基底膜是一种稳定和致密的片状结构，主要由Ⅳ型胶原蛋白和层粘连蛋白构成，通过不同的网络桥接蛋白相互连接，将组织分隔成不同的隔室。细胞与基底膜的连接对于建立上皮细胞极性、组织发育和稳态维持至关重要。在结直肠癌等上皮性来源肿瘤中，基底膜是癌细胞侵袭、浸润和外渗的结构屏障。

脱落的肿瘤细胞在开始播散前，首先必须要越过或绕过邻近细胞，侵入邻近组织。癌细胞通过产生并分泌MMP来改变细胞外基质，从而促使其离开原发灶。MMP家族是一类需要锌和钙来表达催化活性的内源性蛋白酶，可以降解细胞外基质中的大分子（如胶原蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖），从而解除癌细胞侵袭的物理屏障，并促进细胞外基质重塑。MMP家族成员MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9、MMP-13和MT1-MMP在结直肠癌中异常高表达，且其过表达程度与疾病进展和不良预后相关。

细胞外基质的改变是多种不同基质重塑的结果，主要分为四个过程。①细胞外基质沉积：改变细胞外基质组分的组成和丰度，从而改变其生化特质和功能状态；②翻译后水平的化学修饰：改变细胞外基质的生化性质和结构特征；③蛋白水解：释放生物活性细胞外基质片段和结合因子；④应力介导的物理重塑：整合素与细胞外基质分子的结合向细胞外基质分子施加压力，改变细胞外基质分子构象，暴露结合位点以支持自组装成原纤维，从而诱导纤维重排。肿瘤细胞和肿瘤相关基质细胞共同调控上述细胞外基质重塑过程，从而产生促侵袭的癌细胞支持性基质环境。胶原蛋白、弹性蛋白及切割细胞外基质组分的基质金属蛋白酶等在促进肿瘤侵袭和转移方面发挥重要作用。在结直肠癌中，这些与细胞外基质成分正相关的分子普遍高表达。此外，结直肠癌肝转移瘤组织硬度显著高于原发灶组织，在这些肿瘤间质中，转移相关成纤维细胞高度活化，基质降解酶分泌增加，细胞外基质降解和沉积加速，从而使组织硬度增加。

（二）脉管内渗/外渗

在转移过程中，癌细胞内渗（进入外周循环）和外渗（从外周循环进入远处器官实质组织）过程中需要穿过内皮屏障，这些过程涉及各种受体、信号通路以及与周围微环境的相互作用。

1.内渗

内渗是癌细胞侵入血液或淋巴管的过程，始于肿瘤细胞将自身朝向血管和随后的定向迁移。在原发灶形成和生长过程中，肿瘤细胞释放各种可溶性物质和生长因子（如VEGF-A），激活VEGFR 1和VEGFR 2，以促进新血管形成。新生血管比正常血管具有更渗漏的内皮细胞层，有助于肿瘤细胞侵入血管内。癌细胞还可分泌VEGF-C和VEGF-D，激活VEGFR 3，诱导面向肿瘤细胞的淋巴管生成。与新生血管不同的是，新生淋巴管由单层内皮细胞组成，缺乏细胞间的紧密连接，也缺乏基底膜和平滑肌细胞来覆盖内皮细胞层，这种特性使得其更容易被渗入。淋巴管还可分泌CCL21等趋化因子，吸引肿瘤细胞向淋巴管入侵。在脉管内渗过程中，TAM可以“引导”肿瘤细胞进入血管。

2.在外周循环系统存活

并非所有侵入脉管系统的肿瘤细胞都能到达远处定植器官形成转移灶，肿瘤细胞进入血管后，将遭受失巢凋亡、流体剪切力导致的机械损伤，以及免疫系统杀伤等因素的破坏，这些因素均可导致细胞死亡，只有极少数能够存活下来，并最终形成转移灶。

机械应力损伤是导致大部分CTC死亡的主要原因。肿瘤细胞可以通过各种机制保护其免受机械应力导致的细胞死亡，最常见的方式是形成肿瘤细胞-血小板微聚集体，从而对CTC进行物理屏蔽，保护癌细胞免受流体剪切力的机械损伤。此外，集体迁移的癌细胞簇中，位于内部的细胞受机械应力伤害较少，更易存活，因此，集体迁移的癌细胞比单个迁移细胞具有更强的转移潜能。

失巢凋亡是一种特殊的细胞程序性死亡，是由于细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离而导致的细胞凋亡形式。进入血液循环的转移性肿瘤细胞由于整合素依赖性锚定作用的丧失而发生失巢凋亡。当整合素与细胞外基质结合并形成黏着斑时，它们会募集信号分子（如黏着斑激酶和衔接蛋白），从而激活促生存的信号途径，包括PI3K-AKT信号转导和RAS-RAF-MEK-ERK通路。当癌细胞脱落后，这些促生存途径失活，从而发生失巢凋亡。因此，抑制失巢凋亡是肿瘤细胞获得侵袭转移能力的首要因素。肿瘤细胞可以通过激活多种信号通路抵抗失巢凋亡，包括酪氨酸激酶受体途径、整合素途径、Wnt信号通路、NF-κB通路、TGF-β通路、Rho-GTP酶和PI3K-AKT-GSK3等信号通路。

渗入循环系统的肿瘤细胞还面临来自具有免疫监视功能的外周免疫细胞的威胁。自然杀伤（natural killer，NK）细胞作为机体固有免疫的重要成员，是抗肿瘤免疫的先行者，在肿瘤免疫方面发挥至关重要的作用。NK细胞的活性受抑制性受体和激活性受体之间的平衡调控，激活型受体主要包括自然细胞毒性受体、Fc受体CD16、NKG2D及激活性杀伤细胞Ig样受体（killer cell Ig-like receptor，KIR）；抑制性受体主要包括抑制性KIR和异源二聚性NKG2A/CD94受体。与T细胞和B细胞不同，NK细胞不需要特异性的抗原刺激，可以辨识并杀伤细胞表面Ⅰ类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex class Ⅰ，MHC class Ⅰ）分子表达水平低的细胞。当机体内出现肿瘤时，NK细胞表面的激活型受体识别肿瘤细胞表面相应配体，释放穿孔素和颗粒酶，发挥抗肿瘤的细胞毒性作用。NK细胞功能缺陷或耗竭显著促进肿瘤生长和转移。肿瘤细胞从多个方面抑制NK细胞的杀伤作用，逃逸先天免疫监视。例如，肿瘤细胞表面的NKG2D配体可被金属蛋白酶切割，导致肿瘤细胞表面的配体量减少。肿瘤细胞还可以分泌TGF-β、前列腺素E2，以及腺苷或吲哚胺2，3-双加氧酶等免疫调节分子抑制NK细胞活性。

3.外渗

尽管肿瘤细胞通过各种调控机制在血管内环境中生存下来，它们最终的转移潜能取决于其快速外渗到周围实质中的能力。外渗的机制及侵袭与内渗相似，其过程可以是主动的，也可以是被动的。循环中的细胞在某个特定部位的外渗或归巢取决于该部位循环系统的组织学特征，以及肿瘤细胞和内皮细胞之间的特定相互作用模式。例如，骨髓中的血管具有单层内皮细胞，这种结构有利于红细胞进出骨髓，也因此为CTC外渗提供了便利，使骨髓成为多种癌症（如乳腺癌、胃癌和前列腺癌）转移的首选目的地。在结直肠癌，门静脉循环直接从肠系膜引流到肝脏，将肿瘤细胞输送到肝脏微血管系统；而肝窦是肠胃道血液回流的部位，也是肿瘤细胞较容易着床之处。因此，尽管肿瘤细胞本身可能对肝脏环境的适应能力较差，但由于这种解剖学优越性，结直肠癌仍然具有很强的肝脏转移倾向。

肿瘤细胞渗出血管壁的过程需要整合许多因素及事件，包括黏附到内皮、调节内皮屏障和跨内皮迁移到达内皮下层组织。肿瘤细胞到达转移部位后，首先由于毛细血管的物理性截留而停滞，继而与内皮细胞黏附，在血管内迁移或增殖，然后外渗。单个肿瘤细胞也可以直接穿过内皮细胞间隙，侵入周围实质组织。外渗的主要方式是细胞旁迁移，即肿瘤细胞在两个内皮细胞之间的间隙中迁移，这个过程需要细胞骨架重排以及破坏内皮细胞之间连接。在极其罕见的情况下，肿瘤细胞也可以通过穿透单个细胞体穿过内皮细胞，这一过程称为跨细胞迁移。

除了毛细血管对肿瘤细胞的物理截留，肿瘤细胞和内皮之间的主动黏附过程也是外渗和转移所必需的，这种主动黏附过程通常与特定器官的转移倾向性有关。选择素、钙黏着蛋白、整合素、CD44和免疫球蛋白超家族受体在内的多种黏附分子及其受体有助于促进肿瘤细胞和内皮细胞之间的异型黏附过程。

中性粒细胞也参与外渗过程的调节。被肿瘤细胞激活的中性粒细胞的内容物发生脱颗粒化，释放DNA及相关蛋白水解酶，形成中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）。NET可将CTC隔离起来并促进其与内皮的黏附，并通过释放MMP9等金属蛋白酶促使细胞外基质降解，从而促进肿瘤细胞外渗。

单核细胞/巨噬细胞的募集也可以促进肿瘤细胞外渗。例如，肿瘤细胞分泌CCL2，直接募集炎性单核细胞；或通过诱导E-选择素等分子的表达活化局部内皮细胞，间接募集炎性单核细胞，从而促进肿瘤细胞的外渗和转移。此外，肿瘤细胞可以通过诱导内皮细胞高表达血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）和VAP-1来募集髓系细胞，一方面促进肿瘤细胞的存活，另一方面导致血管通透性增加，促进外渗。募集到转移部位的单核细胞在下层组织内分化成转移相关巨噬细胞，这些巨噬细胞通过释放血管内皮生长因子来促进新生血管形成，并增加血管通透性，从而介导肿瘤细胞外渗。

4.趋化因子的作用

趋化因子是细胞因子中的一个大家族，被分为四个不同的亚家族：CXC、CC、XC、CX3C。肿瘤到达转移部位并外渗的过程涉及多种类型细胞间的相互作用，趋化因子在此过程中发挥重要作用。趋化因子通过自分泌或旁分泌方式，增强细胞生存和增殖能力，调节抗肿瘤免疫反应，或促进血管生成。趋化因子不仅参与髓系来源细胞的趋化和运输，也参与肿瘤细胞的迁移、归巢和转移。趋化因子在结直肠癌转移中至关重要，来自不同器官的趋化信号促进结直肠癌细胞的定向迁移。研究表明，趋化因子受体（如CXCR4、CXCR3、CCR6、CCR7和CCR5）高表达有利于结直肠癌细胞向淋巴结和肝脏的定向转移。

（三）转移性定植

转移的肿瘤细胞到达远处器官的实质组织后，增殖形成微小转移灶，一部分微小转移灶最终成长为临床上可以检测到的转移瘤，这一过程称为转移性定植或克隆形成。侵袭-转移级联的所有步骤中，转移性定植形成的成功率很低，这是整个级联中的限速步骤。由于缺乏适宜其生长的微环境因素支持，从循环中外渗的肿瘤细胞将迅速死亡或者被清除，幸存者作为单个播散的肿瘤细胞进入惰性状态或长期休眠状态，或者开始增殖形成微转移灶，这种状态可持续数周、数月，甚至数年之久。成功的转移性定植主要取决于三个先决条件：①维持并启动肿瘤起始癌症干细胞群的能力。一旦休眠的播散性肿瘤细胞从其惰性状态中被唤醒，就可能在转移部位形成克隆性增殖生长。②适应性重编程能力。播散性肿瘤细胞需克服新环境中的各种压力，从而在特定器官的定植并增殖生长。③建立支持性的转移前微环境生态位（详见第三节）。

休眠的播散性肿瘤细胞既具有潜在而且持久的肿瘤初始分化功能，又具备多能干细胞所特有的细胞生物学特性，能够在长时间保持低水平增殖状态，因而具有较高的适应和生存能力。休眠肿瘤细胞的激活受多种因素的调控，这些因素包括表观遗传学调控、新生血管生成、免疫抑制及外科手术等。例如，骨组织中处于休眠状态的微转移灶癌细胞通过表达VCAM-1来募集表达整合素α4β1的破骨细胞，继而促进骨吸收，并促使休眠细胞进入活跃的定植阶段。TGF-β配体的分泌型拮抗剂Coco可以通过抑制骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号传导，特异性地在肺部重新激活先前休眠的转移性乳腺癌细胞。癌细胞从休眠状态重启增殖状态并形成克隆性定植的过程也依赖于局部微环境的支持，包括细胞外基质和间质细胞。例如，层粘连蛋白LAMA4有助于播散性肿瘤细胞在多个器官中的初始增殖；胶原蛋白受体DDR1与TM4SF1相互作用促进肿瘤干细胞增殖，从而使原本处于休眠状态的癌细胞能够在多个器官部位生长形成转移灶。新生血管形成过程中，内皮尖端细胞通过分泌TGF-β1和骨膜素打破休眠并促进肿瘤细胞增殖。

“种子和土壤”假说认为，某些类型的癌细胞比其他类型的癌细胞更易于在特定的远处器官产生转移，意味着播散性肿瘤细胞必须经历某种形式的表型适应才能在这些部位增殖生长。例如，与原发灶相比，播散性肿瘤细胞在远处器官的实质中经历更高水平的氧化应激压力，抗氧化产物的合成增加等代谢适应可能会促进其存活和转移性生长。MET及黏附分子表达上调可以增强细胞间及细胞与细胞外基质之间的连接，从而促进定植。在脑组织中，播散性癌细胞通过表达丝氨酸蛋白酶抑制剂来对抗纤溶酶介导的癌细胞死亡。在肺组织中，播散性癌细胞表面的VCAM-1与巨噬细胞上的整合素a4结合，激活其自身的AKT信号通路，从而促进细胞克隆性增殖。在肝组织中，播散性肿瘤细胞利用细胞外微环境中的肌酸和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）来产生或摄入磷酸肌酸，从而克服代谢应激的压力。此外，支持性细胞外基质也是转移性定植所必须的因素。肿瘤细胞自身可能产生细胞外基质组分，也可以促进驻留基质成纤维细胞分泌细胞外基质组分，从而影响细胞外基质刚性度、增强癌细胞定植的能力。

转移性定植也受到先天和适应性免疫系统细胞的影响。NK细胞和CD8+ T细胞都与转移抑制有关。肺中的富氧环境则可抑制T细胞活性，为转移性定植提供了较为友好的环境。结直肠癌肝转移过程中，肝组织中骨髓来源细胞的浸润也有利于转移性微环境形成（转移前微环境生态位），这些细胞包括MDSC和TAM，其中独特的转移相关巨噬细胞群可能不仅负责引发转移性生长，还负责维持转移性生长。中性粒细胞可以充当促进癌细胞与肝实质相互作用的桥梁，促进肿瘤细胞在肝脏定植。