第三节　基因组稳定性的调控

一、基因组不稳定性与肿瘤发生

生命体需要将遗传物质可靠地传承到下一代，正常体细胞分裂也需要准确地将基因组进行复制，并且均分到两个子代细胞中，以确保子代细胞具有与亲代细胞完全一致的遗传物质。这种将基因组信息由亲代向子代，或由亲代细胞向子代细胞的可靠传递体现了基因组稳定性的特征，其含义包括遗传物质（DNA或RNA）的无差错复制、对复制错误或偶发DNA、RNA损伤的修复；以及分裂期遗传物质的正确分离。与之相反，如果复制过程发生了异常高频的突变，或是分裂或修复过程失败，则会造成子代细胞中各种形式的基因组改变。包括但不限于：基因突变、插入、删除，染色体片段重组，染色体易位，整条染色体重复或丢失，多倍体现象。因为各种原因造成的基因组信息易改变的倾向，即为基因组不稳定性。随着这些改变的积累，细胞的生命活动逐渐受到影响，可造成分裂障碍或生长失衡，甚至发生癌变。

基因组稳定性的维持主要依靠细胞分裂过程中4个方面的共同作用：① S期DNA复制的高保真性；②有丝分裂期染色体的准确分离；③各种DNA损伤和修复机制的有效运行；④细胞周期进行和细胞命运的正常调控。肿瘤发生的分子生物学进程可被视为多次细胞分裂过程中基因组改变的逐步积累（图3-3-1）：具有增殖功能的祖细胞中，关键基因的改变将正常细胞转化为癌前细胞；某些癌前细胞中继发的基因组改变使它们获得继续分裂的优势，这些无限增殖的恶性细胞已经具备了癌细胞的特征；而分裂过程中调控机制的缺陷容许了基因组改变的进一步积累，导致具有更高侵袭性的癌细胞亚群的出现。因此，基因组不稳定性不仅是癌症的重要特征，而且是肿瘤发生的驱动力。

CRC的发生发展与基因组不稳定性密切相关。越来越多的证据表明，肿瘤细胞的遗传学特征不仅决定了肿瘤的发生、进展，也与预后及靶向治疗密切相关。统计结果表明，CRC病例中，60%～80%为不具有家族史或明显遗传因素的散发病例，剩下的20%～35%则是具有家族性或潜在的基因易感性的遗传性病例。与CRC密切相关的基因组不稳定性的形式主要有MSI及CIN。下文分别阐述其相关调控机制及发生原因。

二、CRC相关的基因组不稳定性失调机制

（一）MSI相关的调控机制

微卫星序列是由短串联重复片段组成的重复性DNA序列，重复片段通常只有1～5个碱基对长度。MSI性是一种以微卫星序列中重复单元数量增多或减少为特征的基因组不稳定性形式。Bethesda指南推荐通过5个标志性的微卫星位点评估肿瘤基因组中的微卫星状态，包括2个单核苷酸位点（BAT26和BAT25），以及3个二核苷酸重复（D2S123、D5S345和D17S250）。30%及以上标记性位点展现出不稳定特征的肿瘤为MSI-H，小于30%标记性位点不稳定的肿瘤归类为MSI-L，而未出现明显不稳定性的肿瘤则归类为微卫星稳定肿瘤。约15%的人类CRC病例中可以观察到MSI，而3%～5%的CRC病例最终诊断为遗传性非息肉病性CRC。

MSI主要由DNA错配修复（mismatch repair，MMR）机制障碍而导致。错配修复机制是一种高度进化保守的修复系统，主要用于修复复制错误或者DNA损伤介质造成的碱基对错配。MMR在DNA复制和B细胞的种类转化重组（class switch recombination，CSR）过程中具有重要作用。DNA复制过程中，逃避了DNA聚合酶校对功能的碱基对错配，需由MMR系统来进行纠正。人类细胞中，MMR系统通过DNA链缺口识别新合成的DNA链，MSH2与MSH6或者MSH3分别形成MutSα或MutSβ复合体，首先识别并分别结合于错配碱基对或微卫星复制数错误形成的环状结构，MLH1与PMS2或PMS1构成的MutL复合体进一步结合于MutS复合体，激活其内切酶活性在DNA链上形成缺口。Exo1蛋白通过缺口进入，将错配部位的新生链切除。DNA聚合酶pol δ以切除后形成的单链为模板重新合成错配部位的DNA，之后经DNA单链断裂修复通路的连接酶Ligase1连接。MMR障碍可由MMR关键基因突变或表观遗传学机制导致。HNPCC与MMR基因MSH2、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2等突变相关；而散发病例中的MMR系统失活，则多由于MLH1基因5’端启动子附近的CpG岛的异常超甲基化，导致其转录和表达障碍。

当MMR系统障碍时，DNA复制时造成的碱基对错配和MSI无法得到有效修复，遗留下大量MSI。研究表明某些特定的病理性肿瘤抑制因子突变与MSI息息相关。稀有情况下，某些微卫星序列位于关键性生长调节因子的外显子区域，MMR缺陷引起MSI区域序列长度变化，造成编码区框移，产生无功能的蛋白造成基因失活。已知发现的MSI相关抑癌基因突变包括TGFBR2、IGF2R、BAX、ACVR2、SEC63和AIM2等。这些基因的失活，造成细胞生长增殖的失控，开启了细胞癌变的潘多拉魔盒。

（二）CIN相关的DNA复制、分离和修复缺陷

CIN是高频的染色体水平变化的基因组改变，包括染色体或大范围染色体片段的重复、丢失、重组、易位等，也包括多倍体现象。CIN可导致细胞与细胞间不同的可见核型改变。单个肿瘤中，某些CIN类型可以在所有肿瘤细胞中见到，而某些则具有细胞特异性，说明了CIN从细胞癌前病变开始，不断产生逐渐积累，贯穿于整个癌症的发生与发展过程中。体外的肿瘤细胞培养也可以观察到CIN的出现和逐渐积累，证明了CIN是结直肠肿瘤的特征性改变。约85%的CRC病例中可以观察到CIN。CRC中常见的CIN类型包括染色体臂1p、5q、8p、17p、18p、18q、20p和22q缺失，7号染色体和染色体臂1q、8q、12q、13q和20q重复，以及各种复杂形式的染色体易位等。

与MMR系统相对于MSI的高度特异性不同，CIN相关调控基因的鉴定极具挑战性。时至今日已有100种以上的基因证明具有CIN相关性。MUTYH-相关性息肉病（MAP）是与CRC高度相关的癌前病变，其病变细胞以具有高频的G：C-A：T突变为特征。该疾病患者MYH（又名MUTYH）基因具有双位点胚系突变，多为165位酪氨酸突变为半胱氨酸，或是382位点的甘氨酸突变为天冬氨酸。MYH基因是DNA碱基切除修复（base excision repair，BER）通路的糖苷酶（glycosylase）。DNA氧化损伤发生时，主要会在鸟嘌呤位点形成8-氧-鸟嘌呤（8-oxoguanine，8-oxoG），8-oxoG具有高度致突变性，在DNA复制时可被聚合酶错认为胸腺嘧啶与腺嘌呤配对。MYH可切除氧化造成的8-oxoG位点错误的腺嘌呤配对，故失活时造成大量的G：C-A：T突变；有丝分裂纺锤体检查点（mitotic spindle checkpoint）相关基因调控有丝分裂期纺锤体与动粒的相互作用，确保姐妹染色单体的正确分离。部分含有CIN的CRC细胞中鉴别出来含有MAD基因和BUB等基因突变。MAD和BUB基因产物控制检查点的激活和信号转导，突变时可造成姐妹染色单体分离障碍；中心体数目和功能相关的调控基因与CRC中多倍体的发生也密切相关，多项研究证实了CRC细胞中中心体相关丝氨酸、苏氨酸调节激酶STK15的高表达，MPS1和寿命蛋白（mortalin）等中心体数目调节蛋白，也被证实与CRC的多倍体基因组不稳定相关；细胞周期因子与细胞周期检查点相关蛋白CDC4、端粒酶相关蛋白TERT和RNA转录基因TERC等都会导致CRC中的CIN；除此之外，研究表明DNA双链断裂的同源重组（homologous recombination，HR）修复通路基因ATM、BRIP1、POLD、RAD51等的突变与区域进展期CRC的CIN高度相关。

与MSI相比，CIN带来的基因表达变化往往更多更复杂。除了区域性的突变、框移失活等，含有CIN的结直肠肿瘤往往还具有大量的染色体易位。染色体易位是在细胞失控增殖分裂过程中，DNA因各种原因由基因组中的多个脆弱位点发生断裂后，借由功能异常的DNA的双链断裂HR或者非同源末端连接（non-homologous end-joining，NHEJ）修复通路修复，而导致的异源DNA末端之间的相互连接。这种易位可以导致某种原癌基因被连接至上游的强启动子，从而大量表达，加速细胞生恶性化。而快速的分裂带来更多的CIN，形成恶性循环，进一步增加了肿瘤的侵袭力。

（三）基因组稳定性失调与CRC突变的基因阶段性改变（“Vogelgram”图）

Fearon和Vogelstein在1990年提出了CRC进展过程中不同阶段的基因组改变，又称“Vogelgram”图（图3-3-2）。经后续研究结果补充后，修订后的图清楚展示了伴随CRC进展过程中，基因组稳定性失调带来的多次基因组不稳定性改变，以及产生的癌变后果。APC基因突变失活在高达85%的CRC中可见，与家族性腺瘤性息肉病密切相关。chr5q缺失造成的APC失活是最早观察到的基因组不稳定特征。除了在Wnt信号通路中的作用，突变的APC蛋白还可干扰微管末端与动粒的连接，并影响纺锤体检查点功能，造成有丝分裂异常，加剧CIN形成。当继发的CIN依次造成ch12p、ch18q和ch17P缺失时，造成KRAS原癌基因激活、DCC/SMAD2/SMAD4抑癌基因缺失、TP53抑癌基因缺陷。伴随ch20和ch8q重复及ch8p缺失造成的基因表达改变，细胞分裂增殖能力增强，CIN增多。TP53基因作为“基因组卫士”，守卫着DNA修复、细胞周期检查点、细胞凋亡等门户。TP53基因失活带来了灾难性的后果：具有大量的染色体异常和未修复DNA损伤的细胞被放过进入细胞周期分裂，造成基因组不稳定性的急剧上升，肿瘤由腺瘤转化成癌，癌变过程大大加快。在经历了ch8p缺失后，肿瘤细胞侵袭性增高，成为转移性癌。

三、基因组稳定性调控对CRC预防、治疗和预后的影响

基因组不稳定性加剧了癌变的过程，但同时，充分理解CRC中基因组不稳定性的发生机制，对CRC的预防、治疗和预后评估都具有重要意义。家族性的CRC前病变均具有其遗传学背景，因此具有家族史或在基因检测中发现易感基因的人群需有针对性地执行筛查和预防策略；不同的基因组不稳定性机制造成不同的MSI或CIN形式，而不同的机制缺陷也对不同的治疗策略易感。如PARP抑制剂对HR通路缺陷有协同致死效应，具有用于HR缺陷的CRC靶向治疗的潜力；热休克蛋白90抑制剂通过P53依赖的细胞死亡途径激活AMPK，对多倍体肿瘤颇具治疗功效；而具有MMR缺陷的CRC对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）治疗不敏感，对顺铂和卡铂敏感但却对其类似物不敏感。因此，充分评估肿瘤的基因组信息，对个体化治疗策略的制订非常重要；Carter等设计了一组包含NXF1、P28、v-myb、RERG、STK15等12个CIN相关调控基因的基因表达分析微阵列芯片用于预后评估，结果表明在乳腺癌、小细胞肺癌和CRC中，这些基因的特征性高表达均与肿瘤复发和不良预后密切相关，对于研发基于PCR的CRC临床风险预测和预后评估有极高参考价值。

四、其他的假说和争论

传统观点的“突变体假说”认为在CRC中，因调控基因组稳定性的“守护基因”突变造成的基因组不稳定性在癌前病变中就已出现，并且驱动着肿瘤细胞发展过程中CIN的积累。在遗传性CRC病变中，该假说得到了充分验证。然而依靠蓬勃发展的高通量技术，研究却发现在散发病例中，除了TP53和ATM，并未有其他“守护基因”突变在早期癌前病变中高频出现。因此，近年来，有研究者提出了原癌基因介导DNA复制压力模型（oncogene-induced DNA replication stress model）。该假说认为：散发病例中，原癌基因表达导致DNA复制叉垮塌，从而造成DNA双链断裂和CIN，而“守护基因”的突变则出现于肿瘤发展的较晚阶段，并未参与早期的肿瘤发生。原癌基因导致的DNA复制压力模型解释了早期肿瘤中“守护基因”的低频突变，但原癌基因造成大量复制叉阻滞和垮塌的作用并未得到确切证实。也有研究者提出了“端粒侵蚀”等假说，但均欠完善。因此，散发病例中，CIN的调控和发生机制，仍待进一步研究。

（邵正萍）