第四节　失控性生长

一、CRC细胞的异常增殖

（一）肿瘤细胞异常增殖方式及调控信号

CRC肿瘤细胞维持异常增殖的能力是其基本特点之一。正常结直肠上皮组织通过精确控制生长信号调控细胞增殖和分化周期，维持正常组织结构和功能。而CRC细胞通过多种方式获得持续增殖信号。癌细胞本身可以产生生长因子受体，通过同源受体表达引起自体增殖刺激。另外，支持肿瘤细胞的间质中，癌细胞可能发出信号刺激正常细胞，而正常的细胞则反馈活化各种生长因子，进而促进CRC细胞异常增殖。

正常结直肠黏膜上皮细胞看门基因如APC等出现突变导致其获得选择性生长优势逐渐形成腺瘤，腺瘤虽然生长缓慢，但一旦出现KRAS等基因突变，使GTP酶的负反馈调节失常导致细胞异常克隆性增殖，继而PIK3CA、SMAD4和TP53突变使其发展为具有侵袭性生长和转移潜能等恶性行为的CRC。这些驱动突变导致Wnt、EGFR/MAPK、PI3K-AKT和VEGF/VEGFR信号通路持续异常维持其异常增殖的潜能。

CRC细胞不仅具有诱导持续增殖刺激信号的能力，还具有能够逃逸抑癌基因依赖的增殖负调控程序。Rb和TP53是两个经典的抑癌基因，在调控细胞增殖、凋亡和衰老过程中发挥重要作用。Rb整合细胞内外多种信号决定细胞是否继续进入细胞的生长和分裂周期。CRC细胞通过表观遗传调控Rb表达或存在Rb信号调控通路功能性缺陷，导致细胞周期失控使癌细胞持续增殖。而TP53主要感应来自细胞内的压力和异常传输信号，如基因组损伤、细胞内核苷酸库水平、生长启动信号、乳糖或氧化水平异常，TP53会阻断细胞周期进程，直至恢复正常化。当这些信号持续增强超出可修复程度，TP53会诱导细胞的凋亡。CRC细胞中TP53表达缺失、突变及功能异常导致癌细胞异常修复及耐受凋亡进而表现为持续性增殖。以上以Rb和TP53为例说明CRC细胞具有逃逸抑癌基因的作用，而癌细胞中癌基因与抑癌基因相互作用的调控网络十分复杂，目前仍不清楚，需要进一步研究阐释。

（二）肿瘤细胞侵袭性生长及分子基础

CRC生长过程中，肿瘤细胞具有侵袭性生长特性，侵袭周围组织间隙和脉管系统，表现为局部浸润和远端转移。这些侵袭性生长的癌细胞其形状及与其他细胞和细胞外基质的黏附能力发生改变。E-钙黏着蛋白（E-cadherin）是关键的细胞间黏附分子，促进邻近上皮细胞黏附连接，形成上皮细胞层及维持上皮层的稳定。E-钙黏着蛋白的表达增加可以抵制肿瘤细胞侵袭和转移。而在CRC细胞中通常观察到E-钙黏着蛋白表达下调和偶见的突变失活。

CRC瘤细胞的运动和侵袭能力与EMT密切相关。肿瘤中EMT是指具有上皮样表型的肿瘤细胞转化为具有间质样表型的肿瘤细胞的过程，上皮性标志物如E-钙黏着蛋白、紧密连接蛋白1（zonula occludens，ZO1）等丢失，而间质性标志物如波形蛋白（vimentin）、N-钙黏着蛋白、纤维连接蛋白（fibronectin）和MMP等表达增加；肿瘤细胞在侵袭和转移的过程中，不同程度地短暂或永久激活EMT程序。而EMT过程的具体分子机制仍不清楚，但已知一些经典的EMT转录因子如snail、slug、Twist和Zeb1/2等参与了EMT的调控。这些转录调控因子在不同肿瘤细胞中或者肿瘤进展不同阶段以不同的组合表达，促进肿瘤细胞的侵袭和转移能力。CRC中肿瘤芽被认为是肿瘤细胞发生EMT的形态学表现。肿瘤芽是肿瘤浸润前缘单个肿瘤细胞或细胞数量少于5个的肿瘤细胞团，是一种处于非增殖、非凋亡，具有迁移和侵袭能力的特殊肿瘤细胞。肿瘤芽形态上为长梭形或纺锤形，细胞有伪足形成，上皮性标志物E-钙黏着蛋白表达下降，而间质性标志物波形蛋白和N-钙黏着蛋白等表达增加。

CRC细胞和间质细胞的相互作用同样促进肿瘤细胞的侵袭性生长和转移。例如存在于肿瘤间质中的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）被发现能够分泌CCL5/RANTES响应癌细胞释放的信号，然后CCL5作用于肿瘤细胞，刺激肿瘤细胞的侵袭行为。肿瘤周围的巨噬细胞能够通过提供基质降解酶如金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶促进肿瘤细胞局部浸润。此外，肿瘤相关巨噬细胞还能向肿瘤细胞提供表皮生长因子，而肿瘤细胞反过来用CSF-1刺激巨噬细胞，它们协同的相互作用能使肿瘤细胞更容易侵入循环系统和促进肿瘤细胞的转移扩散。

（三）肿瘤细胞接触抑制机制及作用

正常上皮细胞通过细胞与细胞之间的接触可以抑制细胞增殖，产生融合的细胞层。“接触抑制”机制的运行保证了体内正常组织稳态，然而在肿瘤发生的过程中该机制被破坏。但是，接触抑制及肿瘤如何摆脱接触抑制的分子机制仍不清楚。目前NF2作为肿瘤抑癌基因，编码膜突样蛋白（merlin），其结构与细胞骨架连接蛋白ERM家族［埃兹蛋白（ezrin）-根蛋白（radixin）-膜突蛋白（moesin）］相似，它通过将细胞表面黏附分子（如E-钙黏着蛋白）与跨膜酪氨酸激酶（如EGF受体）相互耦联而形成接触抑制。膜突样蛋白以这种方式强化了钙黏着蛋白介导的细胞与细胞间的黏附性。此外，膜突样蛋白还可以通过孤立生长因子受体而减弱有丝分裂的能力。另外，表皮极性蛋白LKB1参与组织表皮结构并维持组织完整性。当癌基因MYC表达上调时，LKB1能够拮抗MYC癌基因的促有丝分裂效应；而LKB1的表达抑制或失活导致表皮结构不稳定，细胞对MYC诱导的恶性转化更敏感。然而在CRC发生过程中，以上两种接触抑制机制的作用仍需进一步研究。

二、CRC细胞程序性细胞死亡

（一）凋亡

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，以凋亡小体形成为特点，不引起周围细胞损伤，也不引起周围组织炎症反应的单个细胞死亡。细胞凋亡途径分为由BCL家族控制的线粒体内源性细胞死亡途径，以及由死亡受体信号转导控制的外源性细胞死亡途径。

细胞凋亡与CRC的发病机制及其对化疗药物和放疗的耐药有关。正常结直肠黏膜稳态的维持依赖于隐窝底部干细胞增殖和表面上皮组织细胞凋亡之间的动态平衡，而这种平衡破坏后可能导致CRC的发生发展。CIN和MSI是CRC遗传不稳定的两个重要表现。细胞无法识别或修复遗传不稳定导致的错配，这些基因突变能够诱导细胞凋亡；而在一些CRC细胞中，凋亡的信号通路和效应通路失活则导致遗传突变的不断积累，使肿瘤进一步恶性进展，涉及APC/β联蛋白、RAS、TP53等信号通路异常。结直肠腺瘤发生过程出现APC突变，导致Wnt信号通路的异常激活和CIN，肠上皮细胞凋亡和增殖稳态被打破，出现异常增殖形成腺瘤。CRC细胞中RAS/BRAF突变活化MAPK信号通路导致肿瘤细胞抵抗凋亡能力增强，因此利用RAS的激酶抑制剂能够有效抑制其引起的凋亡抵抗。作为转录因子TP53参与许多细胞凋亡调控信号通路，调节了细胞凋亡与有丝分裂信号通路的相互作用，应答多种细胞应激。如TP53促进细胞周期蛋白依赖的激酶抑制基因P21上调，从而导致细胞周期阻滞，与Bcl-2相互调控控制肿瘤细胞的凋亡。TP53还可以通过调控IAP和survivin等多种靶基因诱导细胞凋亡。

（二）自噬

自噬，又称Ⅱ型程序性细胞死亡，是指细胞在饥饿和能量应激等状态下将自身的蛋白、细胞器和胞质进行包裹并形成囊泡，然后在溶酶体中消化降解的过程，包括大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。自噬是一种多步骤、多程序、高度进化及保守的过程，普遍存在于酵母菌、线虫、果蝇及哺乳动物等有机体中，对细胞维持其正常代谢和生存发挥着不可替代的作用。自噬的分子机制主要是以酵母为模型，利用遗传工程方法解析得到，在高等动物和真核细胞中高度保守。目前在酵母中已经发现20多种自噬相关基因，这些基因的功能在高等真核细胞中也高度保守。这些基因在5个重要阶段协调控制自噬这一复杂生物过程：①自噬泡的形成或核化；② Atg5-Atg12结合，并与Atg16L相互作用，形成Atg12-Atg5-Atg16L复合物，共聚到自噬泡上；③ LC3前体形成并加工成细胞质可溶性LC3-Ⅰ，然后修饰成膜结合形式的LC3-Ⅱ，与伸展和延伸的自噬泡融合；④随机或选择性捕获靶内容物，并将其降解；⑤与溶酶体融合形成自噬溶酶体。mTOR和Ⅲ级PI3K/Beclin1复合物等是调控自噬的重要信号转导通路。

自噬在肿瘤中具有“双刃剑”作用，不仅能抑制肿瘤的发生发展，还具有促进肿瘤进展的作用。一方面，自噬可以清除损伤的细胞器以及异常折叠的蛋白质，减少活性氧损伤从而保护正常肠上皮细胞并抑制其恶性转化。另一方面，自噬也能为肿瘤生长代谢提供丰富的营养物质。此外，自噬也可以影响癌细胞的化疗敏感性。在CRC中，自噬对CRC的化疗敏感性既有促进也有抑制作用，例如PCDH17可以通过诱导自噬增强CRC对5-FU的敏感性；而miR-22和IL-6等诱导的自噬导致CRC细胞对化疗的抵抗。自噬这种双重作用可能与诱导的自噬类型有关，但目前仍不清楚，需要进一步研究。

（三）焦亡

细胞焦亡是应对感染时激活的一种程序性细胞死亡，包括胱天蛋白酶（caspase）1依赖的经典焦亡和胱天蛋白酶4/5/11依赖的非经典焦亡。病原体的产物如脂多糖可促进炎性小体的形成激活胱天蛋白酶1。同时脂多糖也可以直接激活小鼠胱天蛋白酶11（人类同源基因为胱天蛋白酶4和5）。然后，胱天蛋白酶1和11都能剪切gasdermin D（GSDMD），使其N端片段在细胞膜上聚集打孔，破坏膜完整性导致细胞裂解。此外，GSDM蛋白家族的其他成员通过类似的机制参与细胞焦亡：gasdermin E由激活的胱天蛋白酶3或颗粒酶B剪切激活；gasdermin B由颗粒酶A剪切激活；gasdermin C由激活的胱天蛋白酶8剪切激活。与凋亡不伴随炎症反应不同，细胞焦亡可以释放出大量由胱天蛋白酶1剪切成熟的炎性物质IL-1β和IL-18激活天然免疫。

焦亡在肿瘤中发挥复杂的作用，焦亡可以直接介导肿瘤细胞死亡，同时也可以激活免疫反应，清除体内的肿瘤细胞。焦亡相关基因如Nlrp3或caspase 1缺失的小鼠更容易发生葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎和CRC。然而，也有学者提出细胞焦亡可能与自噬类似扮演“双刃剑”角色。GSDME介导的细胞焦亡通过释放HMGB1激活ERK1/2途径，促进肿瘤细胞增殖，继而促进CRC的发生发展。

（四）铁死亡

铁死亡是一种铁依赖性的、非凋亡性的程序性细胞死亡形式，在形态、生化和分子机制与细胞凋亡、坏死、焦亡和自噬不同。其实质是细胞内脂质过氧化物代谢障碍。当亚铁离子催化作用产生的活性氧增加，当细胞内合成含多不饱和脂肪酸的磷脂增加，或者当细胞抗氧化能力减弱，使细胞内氧化还原失衡，含多不饱和脂肪酸的磷脂与活性氧反应产生的脂质过氧化物堆积，最终诱导细胞膜损伤，导致细胞死亡。由于该过程依赖二价铁离子，所以被称为铁死亡。形态学上，铁死亡主要表现为细胞体积变小，线粒体体积减小，线粒体膜密度增加，线粒体嵴减少或消失、破裂，细胞核大小正常且保持完整。铁死亡主要有内源性和外源性两种途径。外源性途径是通过抑制细胞膜上的胱氨酸/谷氨酸反向转运体或激活转铁蛋白与乳铁蛋白实现的，内源性途径则直接抑制细胞内抗氧化酶如GPX4活性从而诱导铁死亡发生。

铁死亡与肿瘤的发生发展密切相关。铁死亡同样具有促进和抑制肿瘤的双重作用。小分子化合物（如抑酯酶素和RSL3）、已被批准的药物（如索拉非尼、柳氮磺吡啶、他汀类和青蒿素）、电离辐射和细胞因子（如IFNγ和TGF-β1）可诱导铁死亡和抑制肿瘤生长。然而，铁死亡可在肿瘤微环境中触发炎症相关的免疫抑制，从而有利于肿瘤的生长。在肿瘤转移方面，血液中的高氧化应激环境可能会诱导肿瘤细胞的铁死亡从而抑制其血行转移，而淋巴结环境则能保护肿瘤细胞免于铁死亡。此外，铁死亡会影响化疗、放疗和免疫治疗的疗效。诱导铁死亡可以提高CRC细胞对西妥昔单抗的敏感性，抑制肿瘤细胞的转移。目前铁死亡在肿瘤中的研究处于刚刚起步阶段，仍需深入研究其在肿瘤中的作用和分子机制。

三、结直肠细胞的衰老

（一）衰老的分子机制

细胞衰老是指老化或受损的细胞发生持续性细胞周期阻滞，增殖能力降低的细胞状态。细胞衰老是一种多特征且高异质性的细胞状态，其表征包括但不局限于持续性细胞周期阻滞、溶酶体活性增强、抗凋亡刺激、细胞代谢异常、持续性DNA损伤及衰老相关分泌表型。

端粒被称为细胞有丝分裂的分子时钟，端粒的长度能够反映细胞分裂的程度和潜力，细胞有丝分裂过程中，由于DNA的单向复制特征，复制的DNA末端会出现“不完全复制”现象，导致端粒DNA在细胞有丝分裂过程中不断缩短，当端粒DNA长度缩短到一定“阈值”便能够触发细胞DNA损伤应答机制，DNA损伤相关激酶ATM、ATR、CHK1和CHK2进一步磷酸化P53蛋白，磷酸化的P53蛋白激活周期蛋白依赖性激酶抑制因子P21的表达，P21通过结合周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2），进而抑制细胞DNA复制，造成细胞出现“复制性衰老”现象。

（二）衰老的肿瘤生物学作用

衰老对于大多数物种而言是一种退行性病理状态，常伴随着组织和细胞功能的衰退。但是，在脊椎动物中，衰老能够促进增生性病变的发生，肿瘤与其他衰老性疾病特征相同，大部分类型的肿瘤发病率随年龄而增加，细胞能够通过衰老获得新的特征和功能，与肿瘤的发生发展密切相关。而肿瘤细胞衰老被认为是一种抗肿瘤机制，细胞衰老能够抑制肿瘤细胞的异常增殖。诱导肿瘤细胞衰老不但可以抑制肿瘤的恶性进展，而且能够通过激活衰老细胞的SASP进而诱导肿瘤的免疫杀伤。但有研究显示，P53介导的肿瘤细胞衰老能够降低肿瘤细胞的化疗敏感性和促进肿瘤的复发；化疗药物诱导的肿瘤细胞衰老却能够增强肿瘤细胞干性，促进肿瘤的发生和发展。

CRC细胞常伴有端粒酶表达激活的现象，端粒酶及端粒酶逆转录酶在结直肠腺瘤到腺癌转化过程中表达水平升高，其中myc及Wnt信号通路能够促进端粒酶基因的转录。此外，CRC细胞可由P53/P21信号通路介导其细胞衰老，MDM2蛋白表达增多能够抑制P53蛋白的乙酰化，进而阻止CRC细胞衰老进程，减少衰老相关异染色质点的形成。另外有研究表明，CRC中TRIB2和LRH-1蛋白表达增高，能够显著抑制P21蛋白的表达进而阻止CRC细胞的衰老。CRC细胞中CK1-α表达降低能够促进衰老CRC细胞分泌SASP，引发局部炎症反应，促进肿瘤的发展及转移。细胞衰老在肿瘤中的作用机制目前仍不清楚，其在肿瘤领域的应用仍需大量研究。

（张红河）