第五节　肿瘤干细胞

一、基本概念和起源

异质性是几乎所有晚期癌症的基本特征之一，相关研究证实肿瘤存在广泛的异质性，或者存在具有不同分化状态的肿瘤细胞。这些细胞不仅在生长增殖、侵袭转移以及对治疗反应性等方面有所不同，而且与其周围基质细胞特别是免疫细胞的相互作用等方面也存在巨大差异。对此现象的解释是多方面的，包括不同细胞克隆间的遗传和表观遗传变异，以及代谢和微环境的影响等，而肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）理论认为，肿瘤中存在一个特定的细胞亚群，具有自我更新、增殖、多向分化潜能，与癌症转移、复发或肿瘤药物抗性密切相关，该细胞亚群被定义为CSC。

事实上，CSC的概念起源于20世纪90年代对白血病的研究，发现白血病具有与正常造血系统类似的等级系统，其肿瘤细胞是从一小部分干细胞发展而来，这些干细胞既能自我更新，又能产生一系列分化程度更高的细胞。通过将造血干细胞的定义进行扩展，从而建立了体内鉴定CSC成瘤能力和干性的金标准，即将分离的肿瘤细胞移植给受体小鼠，极少量的细胞（最少至100个）就可以形成反映原始患者肿瘤特征的移植瘤，同时该肿瘤细胞具有无限自我更新潜能，则认为其具有肿瘤干性。

近年来，对CRC干细胞（colorectal cancer stem cell，cCSC）功能特征和分子调控机制进行了大量研究。研究表明cCSC已经不是最初认为的具有明确表型和分子特征的细胞亚群，而是受遗传、表观遗传和微环境共同影响而动态改变的细胞亚群。因此，阐明cCSC驱动CRC进展的机制可能为临床提供新的干预途径，从而最终改善治疗效果。

二、肠道干细胞

小肠上皮由底部隐窝结构及表面绒毛组成，两者间以隐窝-绒毛移行细胞构成，是体内更新速度较快、再生能力较强的组织之一，也是干细胞研究的经典模型，每3～5天更新一次，而新肠上皮细胞是由肠道干细胞（intestinal stem cell，ISC）不断增殖分化产生的。尽管cCSC不一定直接起源于正常ISC，但由于正常和癌变的干细胞往往会依赖于相同的信号通路，因此研究调控ISC的分子机制将有助于加深对cCSC的了解。目前小肠在功能上分为不同的2种肠道干细胞亚群：分裂活跃的隐窝基部柱状细胞高表达LGR5和处于静息状态的“+4”位细胞，即储备干细胞普遍表达BMI1、HOPX、TERT和LRIG1，这两群ISC都具有自我更新和进一步分化出所有肠上皮细胞的能力。

最初研究认为这两种干细胞亚群代表具有不同功能活性的亚群：增殖活跃的LGR5+柱状干细胞被认为是维持肠稳态的原因，而静态的BMI1+储备干细胞则被视为能够再生LGR5+亚群的储备干细胞池。然而，后续研究发现LGR5+柱状干细胞也可以表达“+4”标记（如BMI1等），这就模糊了两个ISC亚群之间的界限。另外，运用谱系示踪技术特异性消融ISC后，肠内分泌细胞、DLL1+分泌祖细胞、标签滞留细胞、KRT19+上层隐窝中的祖细胞和帕内特细胞等祖细胞甚至高度分化的细胞将在损伤刺激作用下逆向去分化，转变成具有干性的ISC。这些研究表明小肠上皮中存在的多种祖细胞具有较高的可塑性，可以在应激情况下逆向去分化以补充ISC。

与小肠相比，结肠在隐窝结构和细胞组成方面存在差异：如结肠隐窝不会在黏膜表面形成绒毛，也不包含帕内特细胞、“+4”位细胞或BMI1+细胞。已有的研究表明，结肠干细胞主要为表达LGR5+或EphBhigh的细胞亚群，当被植入小鼠后具有重建整个结肠的自我更新能力。另外，后续研究还发现了其他的结肠干细胞亚群，如高表达LRIG1或Notch信号的慢分裂干细胞以及表达DCLK1+肠道簇细胞的亚群。然而，与小肠相比，维持结肠干细胞干性或可塑性的分子机制研究还相对薄弱，特别是结肠内寄居着比小肠更多的细菌群落，其作用有待后续研究。

三、CRC的细胞起源

对于多数肿瘤而言，通常认为干细胞是肿瘤恶变的起始细胞，即组织中正常的干细胞获得了向肿瘤恶性转变所需的原始突变积累。在转基因小鼠模型，当特异性激活小肠隐窝底部LGR5+、CD133+或BMI1+正常ISC的Wnt信号通路时，可见腺瘤的快速生长。相比之下，在已分化的细胞中特异性地缺失APC（Wnt通路负向调控因子）只会偶尔导致腺瘤的发生，表明正常ISC比已分化细胞更容易发生恶性转化。虽然正常隐窝中的ISC以随机的方式进行互相替换，但致癌突变赋予了其突变克隆竞争优势，从而较少被野生型ISC替代。值得注意的是，尽管突变的ISC比野生型更有竞争优势，但其细胞命运并不是固定的，仍然有可能被野生型随机替代，从而使得突变积累变得更为复杂。另外，研究还发现在正常条件下P53突变的ISC并不比野生型更有优势，但肠炎的发生将使突变型ISC更有竞争优势。这些实验结果清楚地表明遗传和环境因素共同决定了ISC克隆的竞争能力，影响着CRC的早期发生。

近年来，正常ISC作为CRC起始细胞的观念开始受到挑战，在已分化的绒毛细胞中异常激活NF-κB信号通路（如肠炎或KRAS突变）后，这些细胞变得更易于癌化，但只激活绒毛细胞中的Wnt通路则不足以引发腺瘤。这些现象表明CRC的起始需要Wnt通路以外的其他信号（如NF-κB等）的共同参与，这些信号的存在扩大了CRC的起始细胞范围。因此，错构瘤性息肉病等肠炎人群中的CRC风险增加或许与此机制有关。此外，研究还表明已分化DCLK1+肠道簇细胞在APC基因缺失和葡聚糖硫酸钠诱导肠炎的共同作用下，也可以导致CRC的发生。综上所述，干细胞（如ISC等）、祖细胞或已高度分化的细胞（绒毛细胞等）都可能是CRC的起始细胞。

四、CRC干细胞

多年来，人们一直致力于寻找cCSC特异性的生物标志物，这将极大地促进针对CRC预防和治疗干预工具的研究。最初基于CD133表达高低，运用流式分选分离了人类cCSC干细胞亚群，并异种移植到免疫缺陷鼠，产生了与人源CRC类似的小鼠肿瘤。目前研究已经确定的cCSC分子标志物有EphB2high、EpCAMhigh/CD44+/CD166+、ALDH+、LGR5+和CD44v6+等，但这些标志物通常在正常ISC中也表达，限制了其作为治疗靶标的潜能。近年来，研究还发现DCLK1在cCSC中特异性地高表达，而不表达于ISC中，是潜在的cCSC治疗靶标。

尽管cCSC领域的研究取得了长足进展，但仍然面临着一些问题。首先，cCSC分子标志物的一致性还值得进一步研究，因为其表达本身是不稳定的，研究发现LGR5+ cCSC亚群和LGR5- cCSC亚群可以共存于同一肿瘤，并在化疗时相互转化。此外，肿瘤微环境中的基质细胞也会产生各种细胞因子（如Wnt、TGF-β和R-spondin等）影响cCSC的自我更新能力，并可在应激损伤时促使祖细胞逆向去分化产生cCSC。因此，不仅表达特定分子标志物的cCSC的细胞占比可能会随肿瘤的进展阶段以及治疗方案的不同而动态变化，同时其表达的分子标志物类型和数量也不断发生改变。

五、肿瘤干细胞的可塑性

越来越多的证据表明CSC具有通过基因表达和表观遗传学改变进行适应性状态改变或表型转换的能力，即可塑性。这个概念不仅包含cCSC在耐药性、不对称分裂和分化状态等方面获得不同表型的能力，也包含其他已分化的肿瘤细胞亚群在特定情况下逆分化成cCSC的潜能。早期研究表明，Lac-Z报告基因标记的CD133+和CD133–癌细胞都可导致免疫缺陷鼠中转移瘤的发生。此外，研究还发现LGR5+ cCSC在APCMin/+小鼠辐照后的腺瘤复发过程不是必需的，而KRT19+/LGR5-细胞亚群被发现才是导致腺瘤复发的重要因素。运用白喉毒素特异性地清除LGR5+ cCSC后，发现小鼠的肿瘤生长基本不受影响。此外，运用类器官和人源肿瘤异种移植（patient-derived tumor xenograft，PDX）模型，通过激活caspase 9特异性地清除LGR5+ cCSC从而抑制了肿瘤的生长；然而，当停止清除LGR5+细胞后，肿瘤的复发主要由KRT20+/LGR5-细胞亚群驱动。以上研究清楚地表明表达相关分子标志物的cCSC并不是CRC发生的唯一驱动因素，其他的非干细胞亚群在损伤刺激作用下也可以逆分化成cCSC。

近年来，基于CRISPR/Cas9的无荧光标签标记技术和高通量测序技术的发展，通过分析细胞中随机引入的短序列/突变等遗传条形码来进行谱系示踪。运用此技术，研究发现来源于同一患者肿瘤的cCSC，尽管在遗传上表现出高度的均一性，但在耐药性、不对称分裂和分化状态等方面有诸多不同表型。最近研究还发现cCSC比其他非干细胞具有较高的核糖体活性和蛋白合成能力，但这些高活性基本与cCSC所带有特定的基因突变谱无关。此外，多年的研究也已证实驱动肿瘤发生的关键驱动突变大多发生在早期阶段，而在后续进展过程中仅有有限的功能突变发生。总之，在肿瘤的演进过程中，决定cCSC功能特性的关键因素并不是早期的遗传突变，而是DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质可及性等表观遗传修饰。

六、干细胞巢

肿瘤微环境中不同的基质细胞和细胞外基质共同组成了cCSC的干细胞巢，其组成随肿瘤的发展而不断动态变化，对cCSC细胞的命运决定和功能特征发挥至关重要的作用。运用PDX模型追踪表达GFP报告基因（由Wnt启动子驱动）的cCSC，研究发现驱动肿瘤进展的cCSC主要位于肿瘤的边缘，紧靠微环境中的基质细胞。后续研究也证实来自周围基质细胞的信号在调节肿瘤细胞中的Wnt激活水平上具有重要作用。此外，运用多色谱系示踪系统对来源于患者的cCSC进行更长时间的追踪观察，发现cCSC克隆的大小与其距离肿瘤边缘的物理位置有较大的相关性。这些研究表明cCSC在微环境中所处的细胞位置是肿瘤进展过程中克隆竞争的主要驱动因素。

实际上，处于肿瘤边缘处的肿瘤细胞时刻暴露于来源于其周围间质细胞的信号网络中（如Wnt、TGF-β和R-spondin等），这些细胞因子共同作用影响cCSC的自我更新能力。例如，Lenos等的研究发现基质细胞分泌的骨桥蛋白是肿瘤边缘cCSC克隆竞争性扩增的诱导因素。微环境中肿瘤相关的成纤维细胞旁分泌PGE2，与其周围肿瘤细胞上的PTGER4受体结合，调控Sca-1+肿瘤起始细胞的自我更新能力和肿瘤的发生。

除了微环境中间质细胞可以影响cCSC的干性潜能和肿瘤发生，癌变的cCSC也会影响正常ISC的自我更新能力，从而使微环境中肿瘤细胞和间质细胞的相互交流变得更为复杂。研究发现APC缺失的腺瘤细胞可以分泌NOTUM（Wnt通路拮抗剂），从而抑制同一隐窝或相邻隐窝内正常ISC的干细胞潜能。此外，通过正常和癌变干细胞的独立示踪模型，研究发现受癌基因激活驱动的肿瘤细胞不仅自我分泌抑制性细胞因子从而诱导周围正常ISC的调亡和分化，也会促使其周围其他间质细胞分泌抑制性细胞因子。总之，在肿瘤的演进过程中，受癌基因突变驱动的肿瘤细胞将通过旁分泌影响其他间质细胞，重塑形成对己有利的微环境，从而维持cCSC的自我更新和分化。

七、小结

近年来，所有关于cCSC的研究都汇集到一点：如何重新定义cCSC并靶向cCSC进行肿瘤治疗。学者们逐渐认识到cCSC并非是肿瘤中具有固有特征的特定细胞亚群，而是随肿瘤的演进不断发生动态改变，在不同情况下由不同的细胞亚群承担。这种可塑性除受肿瘤本身和基质等微环境的影响外，同时还有一系列其他未知因素的参与。此外，影响cCSC干性和克隆竞争的决定因素也会随肠癌的不同发展阶段而有所不同。总之，cCSC复杂多变的异质性和可塑性也向人们提出了巨大的挑战，这可能正是目前靶向CSC进行肿瘤治疗失败的主要原因，还有待后续研究。

（刘云华）