第二节　肿瘤相关成纤维细胞

CRC的发生发展与肿瘤微环境密切相关。在肿瘤微环境中，肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAF）作为一种持续活化的成纤维细胞，显示出强大的肿瘤调节功能。研究表明，CAF可通过与肿瘤实质成分的相互作用，分泌多种细胞因子，参与肿瘤微环境的细胞外间质结构、免疫及代谢重编程的构建，从而促进CRC的增殖、侵袭、转移及化疗的耐药性，在CRC的演进中发挥重要作用。CAF与肿瘤细胞的多重相互作用反映出CAF是一个异质性、可塑性的群体，对CRC的影响也具有相互依赖性。因此，对于CAF的深入研究，有助于揭示CRC发生发展的具体机制，并有望作为CRC干预和治疗的潜在靶点。

一、CAF概述

（一）CAF的起源

CAF是指位于肿瘤内部或邻近的成纤维细胞。CAF的起源是多样的，目前研究表明CAF可以通过增殖、激活、分化和募集四种非相互排斥的机制产生。CAF主要来源于肿瘤局部成纤维细胞、从骨髓中募集的纤维细胞、间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、肿瘤细胞相邻的上皮细胞或内皮细胞等。其中，成纤维细胞是CAF的主要来源；在肿瘤中，骨髓来源的MSC可以通过分化转变为相当比例的CAF；肿瘤细胞相邻的上皮细胞或内皮细胞，分别可以通过EMT或内皮-间充质转换（endothelial-mesenchymal transition，EndMT）成为另一类异质CAF群体（图4-2-1）。其余如间质细胞也具有分化为CAF的能力。因此，这些繁多的前体细胞类型也使CAF群体具有明显的原始异质性。

在肿瘤进展过程中，CAF通过分泌趋化因子、细胞因子和生长因子如TGF-β、血小板源生长因子（plateletderived growth factor，PDGF）、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等维持自身活化状态并进一步增殖，从而与肿瘤细胞及其他基质细胞（如内皮细胞、免疫细胞）建立联系。

最近研究发现CAF在CRC的发生发展中同样扮演重要角色。尽管CRC中CAF的起源尚未明确阐明，但越来越多的证据表明成纤维细胞是CRC中CAF的主要来源。实验表明，在CRC细胞分泌的可溶性因子诱导下，TGF-β信号在CAF中被激活，而后可刺激肿瘤细胞进一步分泌TGF-β细胞因子，这表明在肿瘤微环境中TGF-β的产生激活了成纤维细胞向CAF的分化。肿瘤细胞来源的另一个TGF-β超家族成员Nodal通过激活TGF-β/Smad/Snail途径可促进正常成纤维细胞向CAF的转化，从而在体内、外促进CRC的进展。此外，由CRC细胞合成和分泌的细胞因子IL-34也可以刺激正常成纤维细胞呈现类似于CAF的细胞表型。Gong等的研究也显示组织抑制因子MMP1的增加可激活成纤维细胞转化成CAF，因此肿瘤基质在CRC CAF的产生过程中也发挥了重要作用。由此可见，在肿瘤微环境中CRC细胞或基质均可促进成纤维细胞转化为CAF。然而，考虑到CAF的原始异质性，CRC中CAF的来源可能不仅限于上述前体细胞。

（二）CAF的异质性

研究显示，CAF是一种异质性的细胞群，其异质性主要表现在两个方面：标志物异质性和功能异质性。从根本上说，CAF根据生物学功能不同可分为促肿瘤CAF（cancer-promoting CAF，pCAF）、抗肿瘤CAF（cancerretarding CAF，rCAF）、分泌型CAF、炎症CAF和肌成纤维细胞CAF等几种亚型。此外，由单一标志物确定的CAF也可能由几种不同的CAF亚型组成，而这些CAF亚型在肿瘤进展中甚至可能具有功能上相反的作用。CAF由不同的细胞群体组成，因此，CAF的标志物在不同的CAF亚型中也是不同的。最常见的CAF标志物有α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、成纤维细胞特异性蛋白1（fibroblast specific protein 1，FSP1）、成纤维细胞激活蛋白-α（fibroblast activating protein-α，FAP-α）、结蛋白和盘状蛋白结构域受体2、血小板源生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）-α/β，但这些CAF标志物的特异度仍然不够高，它们的表达水平在不同的肿瘤类型中还是有较大差异。

研究报道，基于TGF-β途径的表达，CRC组织中的CAF可被分为CAF-A和CAF-B两种亚型。CAF-A表达与细胞外间质重塑相关的蛋白，如MMP2和成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein，FAP）等；CAF-B表达细胞骨架基因和其他已知的肌成纤维细胞活化标志物，如α-SMA和血小板源生长因子A亚单位（platelet derived growth factor subunit A，PDGF-A）等肌成纤维细胞标志物。此外，来自CRC患者结肠组织的CAF也表达几种去整合蛋白和金属蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM），如ADAM9、ADAM10、ADAM12和ADAM17等。随着CAF潜在标志物的逐渐发现，越来越多证据表明其中的一些标志物与CRC的发生发展有关。有研究显示，胶原蛋白I、PDGFR-β和α-SMA是CAF的分子标志物并与CRC的血管侵袭有关；而CAF标志物α-SMA、CD10和FSP1的表达与CRC的淋巴转移相关。

CAF在其标志物表达方面具有极大的变异性，其各新亚型的特征、标志物表达及功能还有待发掘，对于深入探索明确鉴定这些CAF以及它们在肿瘤中的作用至关重要。

二、CAF对CRC发生发展的作用

（一）CAF对CRC的免疫调节功能

近年来，肿瘤微环境对免疫反应的调节成为研究热点之一。以CAF为代表的基质细胞，在肿瘤免疫调节中的作用呈现出两方面：一方面，CAF可通过诱导肿瘤细胞的慢性炎症来促进肿瘤的发生；另一方面，CAF又通过减轻针对肿瘤的免疫应答使肿瘤细胞得以存活（图4-2-2）。CAF释放的促炎性细胞因子可以协助巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞向肿瘤基质的募集并分化成TAM和肿瘤相关嗜中性粒细胞TAN，并进一步释放几种重要的内皮因子和生长因子，如VEGF、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）、MMP和各种白介素。此外，CAF可以驱动EMT并与M2型巨噬细胞相互作用从而促进恶性肿瘤的进展。

CAF和肿瘤相关的MSC产生趋化因子，如CXCL1、CCL2、CCL5和CXCL12，并诱导多形核骨髓来源的抑制细胞，M-MDSC和Treg细胞的募集，共同抑制肿瘤免疫从而促进肿瘤的进展。除了募集免疫细胞，CAF还可调节这些细胞的免疫抑制特性。CAF是免疫抑制性肿瘤微环境的主要贡献者。CAF通过重塑细胞外基质间接阻止T细胞的运输，从而抑制其抗肿瘤免疫作用。最近有研究显示，CAF可以负向调节抗肿瘤T细胞反应，抗Wnt2单克隆抗体可直接影响CAF分泌的Wnt2，从而恢复CRC中活性树突状细胞T分化及其介导的抗肿瘤T细胞反应。

CAF和结肠肌成纤维细胞都表达PD-L1，PD-L1通过与T细胞上的PD-1结合，使得CAF在抑制T细胞的活化和增殖中起重要作用。CAF如何参与肿瘤免疫监视的研究尚处于起步阶段，需要进一步对其潜在靶分子或CAF亚型进行深入探讨，进而期待改善目前免疫疗法的临床疗效。

（二）CAF对CRC的代谢适应调控

近年来研究表明，肿瘤细胞和CAF之间的相互作用与细胞代谢重编程有关。肿瘤微环境中的成纤维细胞能发挥特有的代谢调节功能，CAF通过改变代谢微环境以满足肿瘤细胞旺盛的营养需求，以利其快速增殖。研究显示，CAF可以通过调节葡萄糖代谢、氨基酸代谢和脂质代谢来促进肿瘤细胞的生长和演进。这些代谢调节作用被认为是CAF影响肿瘤细胞生物学行为的重要表现。

实验证明，即使在有氧条件下，肿瘤细胞也会快速进行糖酵解，从而增加葡萄糖摄取和乳酸分泌，这种现象称为瓦尔堡效应（有氧糖酵解）。CAF在肿瘤细胞的影响下表现出类似的有氧糖酵解，如葡萄糖摄取增加和乳酸分泌增加，相应减少氧消耗，其产生的乳酸被肿瘤吸收利用。在CRC肿瘤组织中分离的CAF也显示出瓦尔堡效应。氨基酸对肿瘤细胞的生长和增殖至关重要，CAF可通过三羧酸循环合成肿瘤细胞生长和进行生物合成所需的氨基酸。谷氨酰胺是碳和氮的重要来源，在CAF与肿瘤细胞相互作用中发挥关键作用。因此，降低肿瘤微环境中的谷氨酰胺水平会影响肿瘤细胞的活力。有研究显示CAF中脂质代谢失调可以影响肿瘤的进展，CAF通过增加脂肪酸合酶的表达进行脂质代谢的重编程，从而产生更多的脂肪酸被CRC细胞吸收。

CAF调节肿瘤代谢的途径有多种，其中，CAF可通过影响肿瘤细胞中与代谢相关的信号通路来调节肿瘤代谢。在CRC中，CAF通过分泌胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）与肿瘤细胞上的IGF1受体结合来激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路，从而引起葡萄糖摄取和乳酸释放，同时也增加了CRC细胞通道蛋白溶质载体家族7成员11的表达，并促进CRC细胞摄取谷氨酰胺，从而增强CRC对术前放疗的抵抗力。

上述研究表明，CAF的存在可诱导肿瘤的代谢重编程，从而促进肿瘤细胞对营养剥夺的适应，维持肿瘤的发生和进展。

（三）CAF对CRC增殖的作用

与正常的成纤维细胞不同，CAF作为肿瘤微环境基质的一部分，通过分泌生长因子、细胞因子和趋化因子，并通过细胞外基质的重塑共同促进肿瘤细胞的生长，例如，CAF通过分泌HGF、TGF-β、基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor，SDF1）、IL-1、PDGF等多种因子促进肿瘤的生长增殖（见图4-2-2）。

除了能够促进肿瘤细胞增殖，CAF也可以通过分泌生长因子如HGF等从而增加和维持肿瘤细胞的干细胞样特性。最近已有研究表明干细胞样特性的维持是肿瘤形成的一个重要影响因素。体内外实验证明CAF促进了CRC的肿瘤增殖，其作用可能是CAF分泌骨膜素、调节肿瘤代谢和CAF衍生的IL-6诱导EMT。此外，miRNA-31、lncRNA UCA1，以及包括PI3K-AKT、FGF-1/-3/FGFR4、HGF-c-Met、ERK5/PD-L1在内的一些信号轴也作为重要的调节剂介导CAF对CRC的促增殖作用，从而形成有利肿瘤发生发展的肿瘤微环境。

（四）CAF对CRC迁移、侵袭及远处转移的作用

许多研究表明，CAF通过重塑细胞外基质、调节EMT、分泌生长因子等途径影响肿瘤的侵袭和转移。据报道，包括CAF在内的基质细胞可以为肿瘤侵袭建立桥梁并促进肿瘤细胞迁移到其他部位。CAF可以通过重塑ECM（见图4-2-2）影响肿瘤的生长、侵袭和转移。此外，肿瘤血管生成不仅是原发性肿瘤生长所必需，而且是肿瘤侵袭和转移的关键因素，CAF还可以通过水解激活血管生长因子蛋白以促进肿瘤血管形成。

在CRC中的研究发现，PDGF激活的CAF可通过分泌斯钙素-1来促进肿瘤细胞的血管内扩张和远处转移。除释放可溶性因子外，CAF介导的肿瘤微环境重构也可促进肿瘤的侵袭和转移。据报道，CRC中抑癌基因SMAD4的丢失会增加TGF-β信号转导的水平，后者可以激活PI3K-AKT通路下游的mTORC2来调节与EMT相关的基因表达水平，TGF-β还可以通过旁分泌途径诱导EMT进一步促进CRC的转移。

肿瘤细胞和成纤维细胞通过促炎性细胞因子的介导在EMT中发挥关键作用。CAF衍生的IL-6可诱导多种肿瘤的EMT，从而促进肿瘤细胞迁移和侵袭能力的增强。另外，研究发现在肿瘤微环境中，CAF是分泌CXCL12的最主要来源，而后者是EMT强烈的激活剂，通过CXCR4/CXCL12轴激活Wnt/β联蛋白途径是导致CRC侵袭和转移的重要机制。

（五）CAF对CRC耐药性的作用

化疗耐药是导致肿瘤进展的常见原因之一。近年来研究表明，CAF可以维持某些肿瘤类型的肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）特性，由于CSC细胞周期循环缓慢或表现为静止休眠状态，导致该亚型本质上即对细胞毒性药物产生抵抗作用，在功能上，CSC被认为是肿瘤发生的驱动因素，也在肿瘤复发和治疗耐药中发挥重要作用。

据报道，在CRC患者中，细胞毒性治疗后观察到CAF数量显著增加，并且CAF可通过增加包括IL-17A在内的特定细胞因子的分泌而促进CSC的形成，从而增加对化疗的抵抗作用。也有文献报道，CAF通过转移像miR-141海绵一样的外泌体lncRNA H19来促进CRC干细胞的形成（见图4-2-2）。

有研究显示，CAF可以分泌HGF并通过C-Met受体激活肿瘤细胞中的MAPK和PI3K-AKT信号，从而在BRAF突变的CRC中对BRAF抑制剂产生耐药。同样，由CAF衍生的HGF触发的平行c-Met信号级联在KRAS野生型直肠CSC中出现，从而也对表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制产生耐药性。因此，与体内西妥昔单抗单药治疗相比，西妥昔单抗和c-Met抑制剂（如JNJ-38877605）同时给药可产生更明显的肿瘤消退。此外，CAF及其衍生的外泌体miR-24-3p可加速CRC细胞产生对奥沙利铂、5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤等常规化疗药物的耐药性。

三、CAF在CRC中的临床应用

（一）CAF与CRC诊断和预后的相关性

除上述CAF与肿瘤发生发展的作用及其相关机制外，CAF在临床中同样具有其诊断和预后价值。近年来，对常用CAF生物标志物在不同肿瘤类型中的预后相关性研究越来越多。有研究报道，与CRC预后不良相关的基因组的表达水平在CAF中显著升高，同时实验表明在转移性CRC患者外周血中存在FAP阳性的CAF，因此CAF的激活与完全缓解（complete response，CR）患者预后有关。已有研究表明，CRC中TGF-β相关基因在肿瘤基质中的表达升高与不良预后相关。α-SMA除了作为CAF的标志物，组织学观察显示其高表达或高基质比例可预测CRC患者的不良预后，因此α-SMA被确定为CRC患者的重要预后因素之一。除α-SMA外，小窝蛋白1（caveolin 1，CAV1）、CD90蛋白和FAP也是与CRC预后相关的CAF标志物。研究发现，表达CAV1的成纤维细胞在CRC肿瘤基质中非常丰富，CAV1通过调节Rho GTP酶活性来参与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重塑，因此基质CAV1的表达与CRC的不良预后有关。CD90+ CAF可直接促进CRC中CSC群体的生长，也参与调控促进CRC进展的肿瘤免疫反应。此外，FAP水平的升高与MDSC水平的升高有关，后者在免疫抑制中起重要作用。FAP水平升高也可以导致CD3+细胞、Th1和NKT的水平降低，以及巨噬细胞、单核细胞和免疫抑制相关的CD11b+细胞的增加。上述研究表明FAP的高表达水平与CRC患者的预后密切相关。

鉴于CAF在肿瘤发生早期即呈现出在肿瘤中的表达增多，未来的研究将致力于发掘有诊断价值的CAF标志物。由于CAF来源的不确定性及同种来源功能的差异性，不同肿瘤表达功能的差异导致需要进一步研究具有特定生物标志物的CAF不同亚型，从而确定其临床预后价值。

（二）CAF与CRC的靶向治疗

近年来，多项CAF与胃肠道肿瘤治疗相关的临床试验正在进行。据文献报道，临床前研究主要通过靶向CAF的激活信号和效应因子、CAF衍生的ECM蛋白以及相关信号转导等来评估CAF对肿瘤治疗的疗效。其中，通过靶向ECM蛋白的产生或降解ECM有利于药物的输送。此外，通过细胞特异性受体将药物靶向递送到CAF可以提高疗效并减少治疗的副作用。

据研究报道，通过间质表皮转换因子（c-mesenchymal epithelial transition factor，c-Met）阻断HGF信号转导的药物处于临床前试验阶段，并有望开展对于肿瘤生长和存活依赖于持续的c-Met激活的患者使用c-Met抑制剂来抑制肿瘤的进展。此外，MMP抑制剂可以通过改变CAF调节ECM重塑的能力来抑制肿瘤的发生发展，尽管大多数MMP抑制剂仍处于早期临床试验。研究人员还使用TGF-β抑制剂或Hedgehog抑制剂联合常规化学疗法或免疫疗法，试图阻断胃肠道肿瘤中与CAF相关的促肿瘤发生信号转导。

事实上，靶向CAF的治疗方法应该区分CAF的不同亚型和功能。在CRC小鼠模型中，FAP+pCAF可被靶向FAP的嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell，CAR-T）消除。此外，针对FAP的DNA疫苗也能诱导CD8+T细胞介导的pCAF杀伤，使得多药耐药CRC模型中化疗药物的肿瘤内摄取显著增加。也有报道称FAP抑制剂或许能消除CRC中的CAF。此外，通过维生素D和维生素A将pCAF还原为rCAF的CAF重编程也引起了广泛关注。目前，不同的靶向药物正在进行临床试验，尽管早期结果尚未表明其确切的疗效。

尽管CAF在CRC的发生发展中发挥重要作用，但针对CAF的肿瘤靶向治疗相关方面的研究仍然处于初期阶段，由于CAF的异质性和多种不同信号通路的同时激活，即使在同一肿瘤内也很难确定治疗靶点。因此，在临床前和临床试验中对CAF亚型进行全面的标志物分析和功能的验证将有助于开发以CAF为基础的新型诊疗方法。

（何宋兵）