第三节　肿瘤新生血管形成

CRC的生长和转移依赖于肿瘤间质持续而充足的血液供应。为了维持肿瘤组织快速生长和播散的肿瘤生物学特性，VEGF和Notch信号通路的激活启动肿瘤血管出芽；促进和抑制血管新生因子平衡的打破，加速肿瘤血管的形成。区别于正常组织的血管，肿瘤组织的血管表现出结构紊乱、通透性强和灌注异常的特征。此外，伴随而来的肿瘤组织缺氧和骨髓源性细胞的浸润，分别通过不同机制进一步加重肿瘤血管的新生。在CRC发生和转移过程中，如何干预肿瘤血管新生，促使肿瘤血管退缩和有序化是治疗CRC的重要策略。

一、血管新生的调控机制

（一）血管内皮出芽

成人的血管在生理情况下处于增殖的静止期，很少产生新的分支，在特定的情况下（修复、肿瘤等）从已有的血管基础上产生新的血管的过程，称为血管新生。对血管新生的观察发现，这个动态过程经历了血管出芽、内皮细胞延伸、新生血管对合、管腔形成和成熟几个环节。其中，血管出芽是血管新生首先出现和最为关键的环节。

如同植物出芽一样，血管内皮细胞在特定条件下，由原本血管基础上产生突起形成“尖端细胞”，随之发生增殖形成管腔形态的细胞称为“茎细胞”。在尖端和茎细胞形成、分化和转换的过程中，促血管生成的VEGF信号通路和Notch信号通路分别发挥着重要的作用。在VEGF释放和刺激下，VEGF作用于尖端细胞特异性表达的血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR 2），激活下游信号通路和促进Notch信号通路δ样配体4（notch ligand δ-like 4，Dll4）的表达。Dll4则与邻近的茎细胞表面Notch1结合，引起Notch1胞内结构域（notch 1 intracellular domain，NICD）的切割和释放，NICD入核、从转录水平限制VEGF信号通路的靶基因，如下调VEGFR 2、VEGFR 3和Nrp1表达，上调VEGFR 1的表达。相较于VEGFR 2，茎细胞表面的VEGFR 1的激酶活性较弱，与VEGF的结合能力强，功能类似于“诱饵”受体，限制内皮细胞VEGF信号通路的活性。另一方面，JAG1是茎细胞特异性表达的Notch受体配体，JAG1可以通过拮抗Dll4和Notch1的相互作用，阻止尖端细胞Notch1信号通路的激活。JAG1在抑制尖端细胞功能和促进内皮细胞分化方面起重要的作用。由此可见，VEGF信号和Notch1的相互作用和动态平衡是促进和维持血管出芽的重要前提（图4-3-1）。

（二）管腔形成

在血管出芽完成后，新生的血管需要具备一定直径的管腔以保持血流通畅。新生血管的内皮细胞可以通过胞饮作用，摄取细胞膜将其包裹；形成的胞饮泡中的细胞膜又重新整合，促使新的细胞内管腔的出现。在这个环节中，内皮细胞、细胞外基质和相邻细胞间的互作维持是管腔形成的关键，受到整合素信号通路，尤其是胶原纤维依赖的α2β1型整合素和纤维素依赖的αVβ3和α5β1型整合素的调控。在一项小鼠胸主动脉管腔形成的研究当中，内皮细胞可以改变自身和邻近细胞的形状及连接方式，从而促进管腔的形成。在小鼠模型中，内皮细胞通过改变位于细胞顶端的糖蛋白的电荷，使得排斥信号产生，伴随着细胞间连接的重排，最终打开新生血管的管腔。

（三）新生血管成熟

随着管腔形成，新生的血管还需建立足够稳定的结构、发挥血管生理功能以达到“成熟”的标准。与出芽环节类似的是，新生血管成熟的环节也受特定血管新生信号通路的精细调控。例如，血管周细胞（足细胞）的募集和内皮细胞间细胞连接的建立是血管成熟的关键。稳定的血管结构和屏障功能的构建还依赖于内皮细胞外围完整基底膜的形成。而这个过程则是受到组织金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）和MMP的相互对抗所调节。上调的TIMP能对新生血管周围的MMP进行降解，从而保障足够胶原的产生和聚集以形成一定厚度的基底膜。

在新生血管成熟的过程中，足细胞的募集是其中最为关键的步骤，受尖端细胞所释放的血小板源生长因子B亚单位（platelet-derived growth factor subunit B，PDGF-B）精细调控。新生血管生长过程中所产生的硫酸肝素聚醣使得PDGF-B在局部聚集，进一步引诱表达对应β型受体（PDGFRβ）的足细胞随之迁移而来。募集而来的足细胞发挥着重要的稳定新生血管的作用。足细胞产生和释放血管生成素，Ang通过与新生血管内皮细胞上的Tie2受体结合使其发生磷酸化，进而激活内皮细胞的AKT信号通路，从而促进内皮细胞的生存；并且通过介导转录因子FOXO1的失活而抑制内皮细胞的凋亡信号。由此可见，在血管足细胞的支持下，Ang1依赖性的Tie2磷酸化使新生血管内皮细胞不断增殖。此外，足细胞-内皮细胞、内皮-内皮细胞间的相互作用是新生血管稳定和成熟的前提。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）可以与细胞膜表面G蛋白耦联受体S1PR结合，促进N-钙黏着蛋白的囊泡运输和表达，从而加强内皮细胞间、内皮细胞-足细胞间的黏着连接而维持新生血管的稳定性。综上，在血管成熟和功能形成的过程中足细胞发挥着重要的作用，通过Ang、S1P等蛋白的释放和调控作用，维持内皮细胞的增殖和促进血管内皮的完整性。

二、肿瘤异常血管新生

与正常组织的血管相比，肿瘤血管显现出异常的形态特点，出现扩张、扭曲和无序化的血管结构。相较正常肠黏膜环状和规律性的排布特点，结肠癌周围的血管显现出明显的扩张、多级分支和紊乱的特征性结构（图4-3-2）。另外，肿瘤组织的血管与正常组织相比更加不成熟，缺乏血管周细胞的覆盖，导致血管通透性高、血流灌注差和缺氧的特点。值得注意的是，肿瘤血管的无序化受肿瘤组织异常激活的促血管新生信号调控，也是抗血管新生治疗重要的切入点。

（一）肿瘤血管新生的激活

肿瘤组织与正常组织相比需要更多的血管以维持养分和养料的供应，以及排出代谢产物和二氧化碳。为了支撑肿瘤组织快速的生长，血管从静止状态转变为持续出芽的新生状态，这样的过程被形象描述为“肿瘤血管新生的开启”。这个开启的过程受到肿瘤微环境中促进或抑制血管新生的因子的调控。这些血管新生调控因子通过与血管内皮细胞表面的不同受体结合，激活下游信号通路，产生促进血管新生或抑制血管新生的不同效应。例如，最常见的促血管新生因子VEGF-A和血管新生抑制因子血小板应答蛋白1（thrombospondin 1，TSP1），在肿瘤血管新生中产生相反的拮抗作用。

VEGF-A是胚胎发育过程中促进血管生成的重要配体蛋白。VEGF-A通过与其对应的三种酪氨酸激酶受体蛋白（VEGFR 1～3）结合，在缺氧和肿瘤的不同病理条件下激活下游VEGF信号通路。VEGF配体的功能也同样受到肿瘤微环境中分泌性因子的影响，例如，MMP9能促进细胞外基质的降解，使得封闭当中的VEGF配体得以释放，结合和激活相应的受体蛋白。此外，成纤维细胞生长因子的升高也能够促进肿瘤血管的持续新生。相反的，TSP1通过与其跨膜受体蛋白结合，从而上调血管新生的抑制信号，以对抗VEGF信号的促血管作用。

在促血管新生和抑制血管新生信号被打破，血管新生通路持续激活的情况下，肿瘤血管出现区别于正常血管的变异形态，包括：未成熟毛细血管出芽，过度和大量分支，扩张的血管管腔，异常的血流、渗漏与出血等。意外的是，异常的血管新生出现在肿瘤早期（非浸润阶段），甚至是更早的癌前病变期，而并非肿瘤进展期。综上，肿瘤微环境中促血管新生和抗血管新生因子的失平衡是肿瘤血管新生开启的关键，导致肿瘤血管特殊结构和功能的产生。

（二）足细胞与血管通透性

生理条件下，足细胞起重要的促进血管成熟和维持屏障功能的作用。在肿瘤组织中，足细胞与基底膜，足细胞与内皮细胞间的相互作用减弱，导致血管形态和通透性的变化。研究发现，在PDGF-B的作用下，足细胞在肿瘤血管内皮细胞的被覆减少，而且与内皮细胞间的连接减弱。缺乏足细胞的支持作用下，内皮细胞虽继续增殖，但形成的血管稳定性下降，通透性高，容易出血。此外，内皮细胞间所表达的VE-钙黏着蛋白是维持血管完整性和屏障功能的重要蛋白。当肿瘤细胞释放大量蛋白酶（如MMP、胰酶和弹性蛋白酶），VE-钙黏着蛋白蛋白发生切割，内皮细胞的相互作用和屏障功能减弱。除此以外，肿瘤细胞还能释放大量炎细胞因子，进一步增加肿瘤血管的通透性。例如，组胺的释放可以持续削弱VE-钙黏着蛋白的功能，从而继续减弱血管内皮细胞间的连接。肿瘤组织表达的VEGF则可通过调节内皮细胞中小GTP酶活性，进而影响肿瘤血管的屏障功能。

除了上述细胞连接作用的减弱，肿瘤血管的基底膜也较正常血管也发生了明显改变。将肿瘤组织切片进行Ⅳ型胶原（基底膜标志物）、CD31（内皮细胞标志物）和α-SMA（平滑肌细胞标志物）免疫组化染色时，结果显示血管的不同组成连接松散，出现较大的空隙，甚至在肿瘤间质中检测到血管内膜组织。除了上述肿瘤血管结构的异常，基底膜自身也出现损伤，表现为不规则增厚和穿孔。这些结构的异常和损伤的发生导致肿瘤血管通透性进一步增加，并且容易发生出血。另一方面，肿瘤细胞更加容易通过高通透性的血管进入血液循环，为血行转移的发生建立条件。

（三）血流灌注与缺氧

与正常组织相比，肿瘤的血液灌注更为复杂紊乱，主要表现为肿瘤的血液灌注分布不均和缺氧。根据血供的不同，常将肿瘤组织分为坏死区、半坏死区、边缘区和富血管区。此外，微血管血流阻力增加，进一步导致了肿瘤组织的灌注减少。肿瘤组织在血液循环中断的情况下生长不会超过1～2mm，当肿瘤血管提供的营养和氧气不足以支持肿瘤细胞生长时，伴有代谢产物的聚集，即出现肿瘤微环境的缺氧。缺氧又可以通过调节细胞代谢、影响上皮-间充质转换以及血管生成等多种机制加剧恶性肿瘤的发展。

正常生理情况下，脯氨酸羟化酶结构域蛋白2（prolyl hydroxylase domain protein 2，PHD2）利用氧气将缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）进行羟基化，促进蛋白酶体依赖的泛素化而降解。缺氧环境中，PHD2失活，HIF-1不被降解而转移至细胞核，与HIF-1β亚基形成转录因子复合物，进而与缺氧反应元件结合，启动下游的调控血管新生、细胞生存和糖代谢的基因表达。上调的基因包括：VEGF、胎盘生长因子、血管生成素2（angiopoietin 2，ANGPT2）、HGF和PDGF-B等促血管生成因子。随后，促血管生成因子与内皮细胞或平滑肌细胞表面的相应受体结合，进一步增加肿瘤血管的新生。例如，HIF-1可以通过增强VEGF的转录活性和mRNA的稳定性，促进VEGF的表达，通过与血管内皮细胞表面的VEGFR 1和VEGFR 2结合，从而促进内皮细胞的增殖和迁移，促进肿瘤血管的新生。

目前，改善肿瘤血管使其有序化、纠正缺氧成为抗血管新生的研究热点。临床研究发现，放疗和化疗药物可能对肿瘤血液灌注及缺氧有所影响。例如，局部放疗可以增加肿瘤组织的血液灌注和减少肿瘤组织的缺氧。有趣的是，抗疟药氯喹通过调控内皮细胞Notch1信号通路的激活，NICD入核和靶基因转录水平的调控，增加肿瘤血液灌注，减少缺氧，从而抑制肿瘤细胞的转移和扩散。

（四）骨髓源性细胞的募集

肿瘤微环境中的间质细胞（tumor-associated stromal cell，TASC）来源于骨髓造血干细胞的募集，在肿瘤微环境中分化形成单核-巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等。此外，TASC还可来源于非造血干细胞，例如，骨髓源性的内皮和间充质细胞，共同参与肿瘤微环境的维持和促进血管新生。肿瘤细胞释放髓细胞趋化因子CCL2、CCL11、CSF1、CSF2、CSF3和VEGF-A等，可将循环中的未成熟髓细胞募集到肿瘤组织中；这些髓细胞从血管渗出后，分别分化为TAM、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等。其中，一些髓细胞在肿瘤微环境中还保持未成熟的表型，如M-MDSC和粒细胞MDSC（granulocytic-MDSC，G-MDSC）。髓细胞通过释放VEGF-A、FGF2、趋化因子CXCL8、Wnt7B等促进血管新生作用。此外，髓细胞也可释放炎症因子IL-1β、IL-6、TNF、MMP和组织蛋白酶等协同发挥促血管新生作用。其中，MMP9可以降解肿瘤组织ECM组分，动员与之结合的VEGF-A释放，进而与血管内皮细胞的VEGFR 2结合，启动肿瘤血管的新生。循环中高表达Tie2蛋白的TAM通过与血管内皮细胞相互作用，以旁分泌促血管新生因子和重塑ECM的两种机制促进血管出芽和成熟。同时，内皮细胞来源的ANGPT2则通过自分泌的方式与自身的Tie2受体结合，促进白细胞渗出和介导TAM与内皮细胞的相互作用，进一步加强肿瘤血管的新生。

肿瘤微环境中的细胞和释放的代谢产物、细胞因子和趋化因子对肿瘤微环境进行着精细的调节，发挥促血管新生或抑制血管新生的作用，以满足肿瘤组织快速生长和侵袭转移的需求。肿瘤微环境中主要的细胞组成、分泌的调控因子及血管新生调控作用总结如下（表4-3-1）。

三、血管新生在CRC进展中的作用

（一）血管新生与CRC的发生与转移

肿瘤血管新生是CRC肿瘤生长和转移的基础，肿瘤组织的血管密度、形态和功能均出现与正常肠黏膜的明显差异。CRC肿瘤组织的微血管密度（microvessel density，MVD）检测发现，腺癌组织的MVD明显高于正常肠黏膜或结肠息肉组织，并显示出与肿瘤血行转移的相关性。在对重要的促血管生成因子VEGF进行关注时，发现CRC组织中VEGF及其受体蛋白的表达与MVD成正相关，且与局部淋巴管浸润、神经浸润，以及肿瘤的远处转移成正相关。这些研究提示血管新生是CRC恶性转化和进展的危险因素。

炎症反应是CRC演进中的重要环节，也决定了CRC肿瘤组织中特殊的肿瘤微环境构成。其中，COX-2在炎症刺激下激活，通过产生PGE2，调节微环境中VEGF的活性，促进血管内皮细胞的迁移和血管新生。研究证明，COX-2和VEGF的上调在抑癌基因APC突变的小鼠肠癌形成中发挥重要的促肿瘤生长和促血管新生双重作用。肿瘤微环境中下调的趋化因子CCL19可通过与趋化因子受体7结合，抑制ERK信号通路及下游的HIF-1α活性及VEGF-A的表达，从而发挥抑制肿瘤血管新生和抑制肿瘤细胞迁移的作用。同属于Tie2配体的Ang1和Ang2是血管成熟的重要调控因子，Ang1激活Tie2而发挥促进新生血管成熟和有序化的功能；而Ang2则很大程度降低血管的稳定性，可促进CRC肿瘤细胞的转移。此外，血管调控因子FGF、PDGF等在CRC中异常升高，通过VEGF通路的激活促进肿瘤血管新生，满足肿瘤生长和扩散的需要。

（二）靶向VEGF通路在CRC中的应用

肿瘤血管新生极大程度促进CRC的生长和转移。抑制肿瘤血管新生通路，促进肿瘤血管的成熟和有序化是目前抗血管新生治疗的策略。研究发现，CRC肿瘤组织中以VEGF上调最为显著，而阻断VEGF通路成为CRC抗血管新生治疗的重要靶点。

靶向VEGF方面，贝伐单抗成为FDA第一个批准临床使用的抗VEGF单克隆抗体。贝伐单抗是CRC临床治疗中应用最广泛的抗VEGF药物，可以有效抑制肿瘤血管新生，抑制肿瘤细胞增殖并且诱导其凋亡。在CRC移植瘤模型中，贝伐单抗与氯喹联合使用，可以显著改善肿瘤血管灌注和抑制肿瘤细胞生长。贝伐单抗与奥沙利铂或伊立替康双联或三联用药，与单独化疗相比，可显著改善转移性CRC患者的无进展生存和总生存。靶向VEGFR方面，雷莫芦单抗是抑制VEGFR的人源IgG1单克隆抗体，已被批准与FOLFIRI方案（氟尿嘧啶、伊立替康和亚叶酸）联合，用于转移性CRC的二线治疗。雷莫芦单抗可以选择性靶向VEGFR 2，诱导其胞外结构域构象改变，从而阻止VEGF与靶向受体结合。在Ⅲ期临床试验中，将雷莫芦单抗添加于FOLFIRI的化疗方案中，可延长接受过贝伐单抗、奥沙利铂和氟尿嘧啶化疗的转移性CRC患者的总生存。可溶性融合蛋白阿柏西普是由VEGFR 1和VEGFR 2的配体结合结构域与人IgG1的Fc片段融合形成的蛋白，以高亲和力结合VEGF，并阻止VEGF与VEGFR相互作用。Ⅲ期临床试验表明，阿柏西普与FOLFIRI方案联合，相较于FOLFIRI单独治疗，可显著改善进展期CRC患者的总生存和无进展生存。酪氨酸激酶抑制剂瑞戈非尼被FDA批准用于治疗对标准化疗无效的转移性CRC患者。通过广泛抑制多种激酶活性（包括VEGFR 1、VEGFR 2、VEGFR 3），发挥抗血管生成，阻断肿瘤细胞增殖、转移及免疫逃逸的作用。Ⅲ期临床试验中，瑞戈非尼显著提高了转移性CRC患者的总生存和无进展生存。

综上，随着肿瘤血管新生调控机制研究的不断深入，靶向肿瘤血管新生药物的开发为难治性和转移性CRC患者的治疗带来新的思路。

（吴华　万珊）