第二章　动物药特征多肽鉴别研究

第一节　研究背景

一、动物药的特殊性

近年来中药材的质量成为人们日益关注的问题，由于中药材成分复杂、特征成分不明确，对其进行质量评价及控制难度较大。动物药由于富含蛋白质等大分子物质，其鉴别较植物药更为复杂。目前，动物药在真伪鉴别、成分含量控制和质量评价方面研究突破性进展较少，评价手段还停留在依靠经验、显微和理化鉴别等传统的方法上。《中国药典》2020年版收录的动物药中，除部分品种进行了定量控制外，大多未采用现代检测方法对其质量进行评价，且测定指标多为非专属的氨基酸或常见的盐，如龟甲胶采用高效液相色谱法对L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸进行测定，牡蛎采用滴定法对碳酸钙进行测定。现代技术尚未广泛和完善地应用于动物药质量评价体系中，最主要的原因可能是动物药缺乏专属性有效成分和鉴别方法，研究基础相对薄弱；其中动物药明确的、可标记的、有效的特征性成分研究鲜有记载和报道，这也可能会成为今后构建和完善动物药质量评价体系研究中的难点和重点。目前，除阿胶、鹿角胶、龟甲胶等个别品种外，大部分品种存在物质基础不清晰、作用机制不明确的情况，是中药标准化和国际化必须弥补的短板之一。

动物药与植物药相比，具有以下难点：①成分复杂，药效物质基础不明确。目前从动物药中分离得到的活性成分主要有蛋白质、氨基酸类及其小分子物质。以水蛭为例，水蛭素是目前已知的作用最强的凝血特异性抑制剂，一般从水蛭唾液腺中获得。中医临床多以水蛭的动物全体入药，经高温炮制后入药仍具有较强的活性，水蛭真正发挥临床疗效的是水蛭素还是其他成分，目前尚无定论。②功效多，成分与药效难以关联。动物药大多具有多种功效，目前研究表明其含有蛋白质、多肽、氨基酸、脂肪、脂肪酸、信息素、糖类、酶及丰富的矿物质和微量元素等成分。众多的成分和众多的功效如何对应？不同的功效是否对应着不同的活性成分？各药效成分之间是否存在协同增效的可能性？动物药组成复杂，单以成分为指标，难以实现动物药质量控制的突破。因此，鉴于动物药化学成分研究现状，针对动物药中含量较高、专属性强的蛋白质、多肽类成分开发创新研究方法，阐明化学成分组成，对进一步开展药效物质基础等动物药相关研究具有重要的推动作用。③药性峻猛，大多有毒。虫类药多含异体蛋白，西医学认为，异体蛋白易引起人体过敏反应，以其致敏性损伤机体。目前动物药不良反应、毒性特征不完全清楚，毒性物质基础和中毒机制暂不明确。在历代本草专著和现行《中国药典》中，动物药仅有有毒和无毒的记载及毒力强弱的分级（如大毒、有毒和小毒），尚缺乏客观判断标准。因此动物药的安全性评价也需要加强。④来源复杂，掺伪现象较多。动物药的来源十分复杂（一部分来源于动物的分泌物、排泄物及生理病理产物，如五灵脂、蝉蜕等，或为动物的加工品，如阿胶、血余炭等），再加上饮片加工炮制等原因，很多原有的性状特征无法鉴别。而且《中华人民共和国野生动物保护法》将许多药用动物列入保护动物，而现有人工养殖技术还有待提高，导致目前许多动物药资源紧缺，价格都比较昂贵。在供不应求的市场上，伪品、劣品、混淆品和习用品泛滥，这使动物药真伪优劣的质量把控有更大的难度。

动物药活性成分质量评价方面，活性/毒性蛋白质、肽类成分的研究发现主要有两个思路：一个是活性导向的成分分离、纯化与鉴定研究；另一个是基于转录组-蛋白质组-多肽组等多组学联合应用，结合生物信息学分析、筛选、合成及验证活性/毒性蛋白质、肽段的研究思路。前者的研究思路早期被用来分离纯化天然毒素类成分，如芋螺毒素、蝎毒和蛇毒等，因活性或毒性强烈，选择合适的活性导向评价指标，可精准锁定活性成分，纯化并鉴定多种毒素类成分，然而这个思路并不适用于动物药中活性蛋白质、肽类成分的发现。

动物药的物质基础与天然毒素类成分的特性不同，大部分动物药按传统加工炮制方法处理后使用。来源于动物药的饮片或提取物中主要为变性蛋白、非特异性降解肽段等成分，与基于天然空间结构产生剧烈活性/毒性的蛋白质、肽类毒素完全不同。如从全蝎分泌的毒素中分离发现了具有多种生物活性的多肽，然而中医临床对全蝎的使用则是经过煎煮、浓缩，最终制成相应的中药汤剂或中药配方颗粒来发挥功效，这种起效方式特点与蝎毒天然毒性肽截然不同。因此，对于动物药功效物质基础的研究需要有特定的方法和手段，以解决动物药特有的科学问题。

二、动物药水溶性特征多肽的研究进展

由于动物药的外观性状突出，传统上对其的质量控制方法多以外观性状鉴别为主，如“方胜纹”的蕲蛇、“通天眼”的羚羊角、“乌金衣”的牛黄等。但此方法也存在一定的缺点，要求检测人员具备辨别各种动物药性状鉴别特征的经验，具有局限性和主观性，结果准确性不稳定；同时也要求药材和饮片的完整性，具有特定的微观或宏观可视性特征，否则难以作为鉴别同属近似种、动物甲壳类、胶类、炮制品类药物的专属性方法。中药配方颗粒作为中药饮片的替代品，在外观上已经不具备中药材的性状，无法从外观上对中药配方颗粒进行鉴别。因此，建立一种不以外观性状为依托，专属性强、准确性高的动物药质量控制手段，是提高动物药质量控制的需要，更是动物药配方颗粒质量控制的要求。动物药经煎煮、熬制后，胶原蛋白发生非特异性降解，形成水溶性良好的肽类成分，部分肽类可透过生物膜吸收入血而发挥多种生物效应。这些研究结果提示，胶原蛋白来源的肽类成分可能为胶类动物药的关键功效物质基础，在胶原来源肽类成分的系统鉴定、表征基础上，可结合传统功效及其相关性等方面开展深入研究。

动物药主要富含蛋白质与分解的氨基酸、多肽等大分子生物信息物质，对于测定其中的活性成分及如何对整个药材质量进行评价，近年来也进行了多方面的研究。随着生物质谱技术的飞速发展，基于质谱的蛋白质组学研究日渐成熟，以肽生物标志物为基础的蛋白质组学技术为动物药鉴定提供了一种新思路。通过高分辨质谱对蛋白质的酶解肽段进行分离鉴定，寻找不同物种的专属特征肽，再利用高效液相色谱串联质谱提取特征肽的离子对信息进行定性和定量，从而实现对动物药的质量评价。这种方法具有高稳定性、高灵敏度、高准确性和高通量等其他方法无可比拟的优越性。从分子遗传学角度研究，由于不同物种DNA序列不同，其表达的氨基酸序列同样也存在差异，这样不同来源蛋白酶切产生的肽段具有一定的特异性。特征多肽为不同物种专属表达的肽段，具有物种特异性，是基于特征多肽建立的质量控制方法，具有专属性高、针对性强的特点。《中国药典》2015年版中已在阿胶、鹿角胶、龟甲胶的鉴别项中加入离子对测定。《中国药典》2020年版中，阿胶的含量测定项引入了特征多肽的定量测定，采用高效液相色谱-质谱法测定驴源多肽A₁和驴源多肽A₂的含量。至此，特征多肽作为质量指标正式出现在我国的官方法典中，也结束了法定标准中动物药无专属性质量控制成分的局面。因此，高效液相色谱-质谱法测定特征多肽的方法在未来将发展成为动物药质量控制的主要手段，同时，其在动物药配方颗粒质量控制上的应用也将成为未来发展的一个趋势。

现在学术界对生物大分子蛋白质和多肽的鉴定分析关键采用基于通过利用蛋白电泳、纳流液相色谱等其他蛋白质组学技术，对蛋白和多肽及其消化后所得多肽片段进行分离后，联合应用高分辨质谱和三重四极杆质谱仪，从中得到肽质量指纹图谱（即一级质谱），再通过对一级质谱及二级质谱进行分析，并在数据库里寻求匹配，根据肽段有规律碎裂的特点，确定氨基酸序列，极大程度上增强了对复杂蛋白和多肽的解析能力。刘宇文等通过采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱和数据处理软件对酶解后的鳖甲胶样品进行分析处理，查找鳖甲胶的特征肽段，找出鳖甲胶的特征离子，鉴定并确定鳖的I型α2链胶原蛋白，利用特征肽段二级质谱图，确定了专属性检测离子对，并建立了具有专属性的鉴别方法。席丽等建立高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱（HPLC-Q-TOF-MS/MS）方法进行初生瘤牛下丘脑多肽组学研究，通过nano-HPLC-Q-TOF-MS/MS数据获取技术及基于数据库搜索软件的使用来鉴定蛋白多肽，为后续研究奠定理论基础。由此可见，以高分辨质谱和LC-MS/MS为核心技术，并结合蛋白电泳、色谱分离和肽段测序等手段，可解析多基原、角类、动物甲壳和胶类动物药与饮片中的标志性蛋白和多肽等，以确定它们的特征多肽，并建立起动物药标准汤剂的关键鉴定技术。