第二节　特征多肽的筛选研究流程

一、具体研究内容

本研究选择了临床上常用的鸡内金、炒鸡内金、土鳖虫、水蛭、鳖甲、醋鳖甲、地龙、蝉蜕、僵蚕、炒僵蚕、醋龟甲等11味动物药作为研究对象，通过筛选各动物药的特征多肽，建立11味动物药标准汤剂及配方颗粒的特征多肽质谱MRM鉴别或含量测定方法。为动物药配方颗粒提供一种灵敏度高、专属性强的检测手段，更好地对动物药配方颗粒的质量进行把控，同时也能够很好地解决部分动物药配方颗粒的掺伪问题。为后续动物药质量标准的提升以及配方颗粒的开发起到一种示范性的作用。具体包括以下研究内容：

（一）药用样品的采集与炮制

收集具有代表性的研究样品，所用药材产地应覆盖品种生产拟采用药材的道地产地或主产区，每个药材产地不少于3批，并对样品批次数量从产地环境条件、质量水平等方面的代表性进行合理评价，应收集15批以上药材样品。若该品种为多基原品种或者有常见的伪品，还需要收集一定数量的不同基原样品以及伪品。

所采集的样品质量需符合《中国药典》2020年版或者其他中药材地方标准中的相关要求。并按照相应的炮制通则方法，将其炮制成符合要求的饮片。

（二）标准汤剂的制备

在充分研究古今文献的基础上，考虑中药药性、药用部位、质地等因素，并参照原卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号文），固定前处理方法、煎煮次数、加水量、煎煮时间等相关参数进行煎煮。再采用合适的固液分离方式进行滤过，在低温条件下对煎液进行浓缩和干燥处理，最终制备得到标准汤剂冻干粉。

（三）特征多肽的筛选

动物药配方颗粒特征多肽的研究关键是筛选出该品种的特征肽段，肽段的特征性在于为该品种或者该物种所特有的，能够与其他不同基原伪品或者其他物种品种进行有效的区分。本研究特征肽段的筛选采用了蛋白质组学的“Bottom-up”策略，即使用高分辨液质联用仪采集酶解后溶液一级和二级质谱数据，然后将数据导入软件进行搜库处理，匹配出已知的多肽序列，选择其他伪品或者物种不具有的肽段作为特征肽段，最后将筛选的特征多肽序列进行人工合成，以验证序列的准确性。特征多肽筛选的技术流程图如图2-2-1。

（四）特征多肽质谱MRM鉴定或含量测定方法的建立

首先优化上述所筛选的特征肽段的色谱条件以减少分析时间，选择MRM模式响应最高的离子碎片，提高特征肽段检出灵敏度；其次对鉴别方法以及含量测定方法进行方法学考察，对于MRM鉴别方法，主要是验证方法的专属性、检出限以及耐用性；对于MRM定量方法，除了包括鉴别项的验证项目外还需要对定量限、精密度和准确度进行验证，以保证方法能够准确定量；最后采用经验证后的方法对所有批次样品的饮片和标准汤剂进行检测，确定量值传递规律。

（五）掺伪的研究

在对品种特征多肽的筛选过程中，同时对常见伪品的特征多肽进行筛选，筛选出能与正品进行区分的伪品特征多肽。并且对伪品掺伪的比例进行研究，以有效地控制动物药配方颗粒的掺伪现象。

二、研究方法与技术路线

（一）药用样品的采集与炮制

研究样品采集需要有代表性，应覆盖品种生产拟采用药材的道地产地或主产区，每个药材产地不少于3批，应收集15批以上药材样品。收集一定数量的不同基原样品以及伪品。所采集的样品均需要按《中国药典》2020年版或其他中药材地方标准进行检验，各项指标均符合要求后才能进行进一步的炮制。炮制按《中国药典》2020年版炮制通则方法进行，炮制后的饮片再按《中国药典》2020年版或其他中药材地方标准进行检验合格后才能使用。

（二）标准汤剂冻干粉的制备

为了能够指导配方颗粒工艺和质量的研究，需要将合格饮片制备成标准汤剂。参照原卫生部、国家中医药管理局《医疗机构中药煎药室管理规范》（国中医药发〔2009〕3号文），按照相关参数进行煎煮。然后使用旋转蒸发仪在65℃或以下的低温条件下对煎液进行浓缩，最后采用冷冻干燥技术将浓缩煎液干燥成冻干粉，以最大限度地保留了煎液有效成分，并且有利于标准汤剂的贮存。

（三）特征多肽的筛选

根据研究对象所含蛋白的类型不同，采取以下两种实验路线进行特征多肽的筛选：

1.实验路线一

直接利用蛋白数据库筛选。

（1）蛋白提取：

取饮片和标准汤剂以1%碳酸氢铵溶液进行超声提取，再以0.22μm微孔滤膜滤过，得续滤液。

（2）酶解：

取续滤液使用胰蛋白酶溶液（取序列分析用胰蛋白酶，加1%碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用时配制）进行酶解，酶解条件为37℃恒温酶解12小时，得酶解后的多肽供试品溶液。

（3）数据采集：

将供试品溶液注入 Thermo Q-Exactive Focus 液质联用仪，采用电喷雾正离子模式（ESI+），调整合适的参数，进行full ms-dd ms2扫描，得到样品的一级和二级图谱（图 2-2-2）。

（4）搜库与数据处理：

在Uniport网站搜索合适的数据库，下载，并导入Thermo Proteome Discoverer或Mascot软件，对质谱数据进行搜库处理，最后将软件搜索到的结果进行对比分析，选取该品种特有并且符合要求的肽段作为方法的特征多肽（图2-2-3）。

2.实验路线二

多肽经纯化后检测再利用蛋白数据库筛选。

（1）水提取：

将药材研磨成粉末，称取适量于圆底烧瓶中，加入100ml水，加热回流1小时，滤过，残渣再加入100ml水加热回流1小时，用纱布过滤，收集滤液，合并两次滤液。取20ml水提物滤液浓缩至2ml。加入8ml甲醇进行沉淀，离心取沉淀，再加入1ml水于沉淀中，得到浓缩的药材水提物。

（2）SDS-PAGE凝胶电泳：

各取10μl的浓缩水提物加入40μl的loading buffer（上样缓冲液）和150μl的超纯水制备成适宜浓度的缓冲液，于热板上100℃加热5分钟失活。精密吸取10μl制好的蛋白样品和标准蛋白（Marker）加入孔道中，然后用30分钟，80V进行压胶；60分钟，120V进行分离；染色30分钟；脱色4～12小时，直至洗去背景能看到清晰的蛋白条带。

（3）胶内酶解：

将切取的蛋白条带转入1.5ml进口离心管中，采用超纯水漂洗两次；再经过脱色、脱水等步骤，加入10μl酶解工作液，吸胀30分钟，再20μl酶解覆盖液，37℃水浴酶解16小时。

（4）肽段脱盐：

使用制备C₁₈膜填充柱进行脱盐处理，脱盐后含多肽样品的溶液进行挥干。

（5）质谱数据采集：

现将多肽样品采用Nano-HPLC液相系统EASY-nLC1200进行分离，样品由自动进样器上样并吸附到Trap column柱上，再经Analysis column，75μm×150mm（RP-C18，Thermo Inc.）色谱柱分离，流速为300nl/min。样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。调整适当的参数，同样进行full ms-dd ms2扫描，得到样品的一级和二级图谱。

（6）搜库和数据处理：

将质谱数据导入 Thermo Proteome Discoverer或 Mascot软件，采用合适的Uniport数据库，进行搜库处理。将软件搜索到的结果进行对比分析，选取该品种特有的、符合要求的肽段作为方法的特征多肽。

（四）特征多肽质谱MRM鉴定或含量测定方法的建立

（1）条件的优化：

根据已选定的肽段，相应地调整流动相等色谱条件以减少分析时间，调整电喷雾能量和温度、碰撞能量等质谱条件以增加检测离子的灵敏度，选择响应最好的离子作为MRM的检测离子。

（2）方法学验证：

对于MRM鉴别方法，主要是验证方法的专属性、检出限和耐用性。若为多基原品种的验证着重所选离子在不同基原之间的专属性，若不能区分相同种属的特征多肽要验证相近种属之间的专属性；对于MRM定量方法，除了包括鉴别项的验证项目外还需要对定量限、精密度和准确度进行验证，以保证方法能够准确定量。

（3）样品检测：

采用经验证后的方法对所有批次样品的饮片和标准汤剂进行检测，确定量值传递规律。

（五）掺伪的研究

在对品种特征多肽的筛选过程中，同时对常见伪品的特征多肽进行筛选，再通过不同比例的正品与伪品进行混合煎煮，考察伪品的最低检出的掺伪比例，以有效地控制动物药配方颗粒的掺伪行为。

（六）总体技术开发路线

本研究总体技术开发路线如图2-2-4。